来源：Cellulose nanofiber-based dual-modal biosensor and machine learning-assisted electrochemical detection of paraoxon in food（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
对氧磷是剧毒有机磷农药代谢物，对食品安全构成严重威胁。本研究开发了一种便携式双模态生物传感器，将快速比色筛查与机器学习辅助的电化学分析相结合。平台核心是纤维素纳米纤维（CNF），它既是酶固定化基质，又驱动毛细管被动吸样。石墨烯/CNF纳米复合界面加速电子传递，检测线性范围0–1.0 ppm，检出限86 ppb。在水果和水样中验证了实用性。
研究背景
食品安全领域对先进生物材料的需求日益迫切。纤维素纳米纤维（CNF）因其高长径比、大比表面积和丰富的羟基基团，成为酶固定化和生物相容性传感的理想平台。这些特性使CNF有望应对一个全球性挑战：新鲜水果和水体中的有害农药残留污染，尤其是那些生食或 minimally processed 的农产品。
在各类农化污染物中，有机磷（OP）农药因强神经毒性被视为最危险的类别之一，其毒性往往超过氨基甲酸酯类农药。有机磷通过抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）发挥毒性——该酶负责调控神经信号传导。抑制导致乙酰胆碱在神经系统中积累，引发持续神经刺激，造成肌肉震颤、呼吸衰竭甚至死亡。即使低浓度也具有高毒性，因此食品和水中其含量受到严格法规管控。在对氧磷等OP化合物中，对氧磷作为对硫磷的毒性代谢物尤为危险。
研究方法
2.1 材料与试剂
碘化乙酰硫代胆碱（ATCh，>98%）购自比利时Acros Organics。对氧磷-乙基（>95%，HPLC级）购自日本东京化成工业（TCI）。磷酸盐缓冲液片剂（PBS）、人重组乙酰胆碱酯酶（在HEK 293细胞中表达，冻干粉，≥1000 units/mg蛋白，分子量64.6 kDa）、碘化乙酰硫代胆碱、DTNB（Ellman试剂）（5,5-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)，>98%）均购自美国Sigma-Aldrich。纤维素纳米纤维（CNF）2.8%wt.水分散液（由超微磨制备）购自加拿大Cellulose Lab。导电石墨烯分散液购自美国Graphene Supermarket（纽约）。1号滤纸购自英国Whatman。丝网印刷碳/石墨烯电极（SPGE）（产品代码：CI1703GR）购自泰国Quasense Co., Ltd.。所有试剂均为分析级，购自美国Sigma-Aldrich，未经进一步纯化直接使用。实际水样包括饮用水、矿泉水和自来水，采集自泰国曼谷各地。新鲜水果样品——番石榴、麝香葡萄和中华梨——购自泰国曼谷当地超市。
【数据】ATCh纯度：>98%；对氧磷-乙基纯度：>95%（HPLC级）；AChE酶活：≥1000 units/mg蛋白；AChE分子量：64.6 kDa；DTNB纯度：>98%；CNF浓度：2.8%wt.；SPGE产品代码：CI1703GR
2.2 表征方法
形貌表征使用JEM-2100透射电子显微镜（TEM，日本电子光学实验室株式会社，日本）。表面形貌和元素组成分析使用JSM-6400扫描电子显微镜（SEM）（日本电子光学实验室株式会社，日本）。表面粗糙度和面积测量使用LEXT™ OLS5000激光共聚焦显微镜（奥林巴斯株式会社，美国）。电化学测量使用Metrohm电化学仪（型号910 PSTAT mini）。所有比色测量使用ImageJ颜色分析软件（美国国立卫生研究院）。修饰电极的表征采用衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR），使用Bruker FT-IR光谱仪（型号ALPHA II），频率范围400–4000 cm⁻¹。化学组成和表面状态分析采用X射线光电子能谱（XPS），使用PHI 5000 VersaProbe II（ULVAC-PHI Inc.，日本）和拉曼光谱仪Raman XploRA PLUS（HORIBA France SAS）。HPLC（Agilent 1100 Series）使用eclipse XDB C-18 4.6 × 150 mm，5 μm色谱柱，以DI水:乙腈=20:80比例梯度洗脱。流速1.0 mL/min，UV检测器波长219 nm。
【数据】FTIR频率范围：400–4000 cm⁻¹；HPLC柱规格：C-18 4.6 × 150 mm，5 μm；流动相比例：DI水:乙腈=20:80；流速：1.0 mL/min；UV检测波长：219 nm
2.3 机器学习：数据增强、验证策略与可解释性
由于实验数据集仅包含39个原始样本，实施了严格的机器学习工作流程以增强模型训练，同时防止数据泄漏并确保分析有效性[37,38]。数据划分与增强方案：为避免评估集污染，原始数据集首先使用分层采样划分为训练集（70%）和独立留出测试集（30%），以保持目标变量（电流）的分布。数据增强仅应用于训练子集，使用高斯噪声注入。每个特征的噪声幅度定义为该特征经验标准差（σ）的分数，反映预期的实验不确定性：CNF负载为0.02σ，AChE浓度为0.015σ，反应时间为0.01σ，测量电流为0.03σ。每个原始训练样本生成五个增强副本，产生n = 162样本的增强训练集（原始n = 27训练样本 × 6副本含原始）。所有增强值在零处截断以强制物理真实性（非负浓度和电流）。增强保真度验证：为确认增强保留了底层数据分布，通过比较原始和增强训练数据集进行双样本Kolmogorov–Smirnov（KS）检验[42]。KS分析表明增强数据总体上保留了与原始训练特征可比的分布，仅在纤维素纳米纤维（CNF）负载方面观察到轻微偏差（表S2）。这些结果表明增强过程引入了真实的变异性，同时大体保留了底层特征关系。模型训练与选择：增强训练集用于使用AutoGluon框架[43]训练多个回归模型。模型性能通过训练集上的内部5折交叉验证评估；具有最佳交叉验证均方根误差（RMSE）的模型被选为最终预测器（WeightedEnsemble_L2）。WeightedEnsemble_L2模型使用优化的集成权重结合多个基础学习器的预测，在评估的模型中实现了最低的交叉验证RMSE。模型选择或超参数调优期间未使用测试集信息。独立测试集评估：最终模型性能仅在未触碰的留出测试集（n = 12）上评估。报告的指标包括RMSE、R²和平均绝对误差（MAE），95%置信区间通过bootstrap重采样（B = 1000次重复）估计以量化不确定性[44]。通过SHAP进行模型可解释性分析：使用SHapley Additive exPlanations（SHAP）[45]对独立测试集进行事后可解释性分析。SHAP值量化每个输入特征（CNF负载、AChE浓度、反应时间）对预测电流的边际贡献（表S3）。分析明确使用测试集特征和预测以避免泄漏；结果以特征依赖图报告以说明机制关系。完整的基于机器学习的传感器优化工作流程如图S3所示。
【数据】原始样本数：39；训练集比例：70%；测试集比例：30%；CNF负载噪声：0.02σ；AChE浓度噪声：0.015σ；反应时间噪声：0.01σ；电流噪声：0.03σ；增强副本数：5；增强训练集：n = 162；原始训练样本：n = 27；留出测试集：n = 12；交叉验证：5折；bootstrap重复：B = 1000
2.4 电化学传感器制备
丝网印刷碳/石墨烯电极（SPGE）的修饰按照Scheme 1a所示步骤进行。首先，用蒸馏水清洗SPGE。随后，将3 μL含0.025%w/v CNF和0.5 mg/mL石墨烯溶液的混合液滴加到准备好的电极上。第一层干燥后，将3 μL的2 unit/mL乙酰胆碱酯酶（AChE）固定在SPGE/G + CNF表面。修饰电极在干燥条件下4 °C保存直至使用。该概念使用AChE修饰电极作为传感器进行评估，以乙酰硫代胆碱（ATCh）作为底物。乙酰硫代胆碱经酶水解产生硫代胆碱。生成的硫代胆碱随后在电极表面被电化学氧化形成其二聚体——二硫代双胆碱。因此，在乙酰硫代胆碱浓度恒定的溶液中，对氧磷农药存在时传感器输出电流降低。因此，对氧磷浓度可通过监测电流的降低来定量[46]（图S1）。
【数据】CNF浓度：0.025%w/v；石墨烯浓度：0.5 mg/mL；混合液体积：3 μL；AChE浓度：2 unit/mL；AChE体积：3 μL；保存温度：4 °C
2.5 电化学测量
电化学测量在Metrohm电化学仪上使用三电极系统进行，包括工作电极、碳对电极和Ag/AgCl参比电极。循环伏安法（CV）在+0.6至−0.6 V电位范围内以0.1 V/s扫描速率进行，安培测量在+0.45 V vs Ag/AgCl下记录。测量前，修饰电极首先与含对氧磷的样品溶液孵育5 min以允许酶抑制。随后，再与底物溶液（碘化乙酰硫代胆碱）孵育5 min以启动酶反应。测量的重现性通过五次独立测定（n = 5）评估，计算相对标准偏差（RSD）。
【数据】CV电位范围：+0.6至−0.6 V；扫描速率：0.1 V/s；安培测量电位：+0.45 V vs Ag/AgCl；对氧磷孵育时间：5 min；底物孵育时间：5 min；独立测定次数：n = 5
研究结果
3.1 电极表征
为确认SPGE逐步修饰的成功（图1），进行了透射电子显微镜（TEM）表征。如图1a所示，石墨烯片保留了其特征性的二维层状形貌，有利于促进快速电子传递。图1b显示CNF纤维网络，平均纤维宽度为72.5 ± 3.9 nm，证实了材料的纳米级结构。石墨烯和CNF的复合物（图1c）表现出良好整合的结构，CNF分布在石墨烯表面，表明杂化材料的成功形成。扫描电子显微镜（SEM）用于评估修饰前后电极的表面形貌。裸SPGE在亚微米尺度表现出相对粗糙的表面（图1d）。用石墨烯和纤维素纳米纤维（G + CNF）修饰后，电极表面变得更加纤维化和互连，反映了纳米材料的成功掺入（图1e）。AChE固定化后（图1f），电极（SPGE/G + CNF/AChE）表面相比G + CNF修饰电极变得更光滑，这可能归因于生物分子层覆盖了底层结构。三维表面形貌图像（图1g–i）显示每个修饰步骤表面粗糙度增加。裸SPGE显示相对均匀的表面（0.88 ± 0.02 μm），而G + CNF的引入略微增加表面粗糙度（1.50 ± 0.04 μm）。酶固定化后，表面变得更加异质，高度分布更宽，表明AChE的成功附着和表面复杂性的增加（4.22 ± 0.21 μm），有利于生物识别过程。
【数据】CNF平均纤维宽度：72.5 ± 3.9 nm；裸SPGE粗糙度：0.88 ± 0.02 μm；SPGE/G + CNF粗糙度：1.50 ± 0.04 μm；SPGE/G + CNF/AChE粗糙度：4.22 ± 0.21 μm
修饰电极的结构和表面特性通过傅里叶变换红外（FTIR）光谱、X射线光电子能谱（XPS）、拉曼光谱和电化学阻抗谱（EIS）系统研究。从三个独立制备电极（n = 3）获得的代表性结果如图2所示。FTIR光谱（图2a）揭示了石墨烯（G）、纤维素纳米纤维（CNF）和AChE酶成功掺入SPGE表面。对应于OH伸缩（3200–3600 cm⁻¹）、COC（1270 cm⁻¹）、CO伸缩（1030 cm⁻¹）和CN（1287 cm⁻¹）振动的特征谱带的出现，确认了CNF和酶官能团的存在，表明有效的表面修饰和生物分子固定化。XPS全谱（图2b）进一步确认了每个修饰步骤后元素组成的变化。值得注意的是，SPGE/G + CNF/AChE电极中403 eV处N 1s信号的出现表明酶固定化成功。裸SPGE（图2c）和修饰SPGE/G + CNF/AChE（图2d）的高分辨谱提供了对化学键合的额外洞察。C 1s谱显示归属于CC/CC（286.5 eV）、CO（287.5 eV）和OCO基团（290.5 eV）的峰，而N 1s解卷积揭示了403 eV处的CN和胺类物种（-NH2/-NH3+），为蛋白质结构的特征。这些结果连同O 1s数据，验证了石墨烯、CNF和AChE的成功整合。如图2e所示，拉曼光谱展示了约1350 cm⁻¹处的特征D带和约1590 cm⁻¹处的G带，分别对应于结构无序和石墨碳。D带与缺陷位点和sp³杂化碳相关，而G带代表有序的sp²碳网络。D/G强度比（ID/IG）从裸SPGE的0.87增加到石墨烯和CNF修饰后的0.96，表明由于表面功能化导致缺陷位点和结构无序增加。这一增加表明纳米材料的成功掺入和额外活性位点的形成，有利于传感应用中的电子传递。值得注意的是，AChE固定化后ID/IG比保持不变（ID/IG = 0.96），表明石墨烯的基本石墨结构得以保留，酶负载未显著破坏碳骨架。EIS结果（图2f）进一步展示了修饰电极的电化学性能。裸SPGE表现出最高的电荷转移电阻（Rct = 1.9 kΩ）。石墨烯修饰将Rct降低至0.9 kΩ，而G + CNF复合物进一步将其降低至0.6 kΩ，表明CNF网络防止石墨烯聚集并促进电子传递。AChE固定化后，Rct增加至0.8 kΩ，归因于绝缘蛋白质层。这些结果确认了逐步修饰的成功以及G + CNF/AChE平台相比裸电极的优越导电性。
【数据】FTIR特征峰：OH 3200–3600 cm⁻¹，COC 1270 cm⁻¹，CO 1030 cm⁻¹，CN 1287 cm⁻¹；XPS N 1s：403 eV；C 1s峰：286.5 eV、287.5 eV、290.5 eV；拉曼D带：~1350 cm⁻¹；G带：~1590 cm⁻¹；裸SPGE ID/IG：0.87；G + CNF修饰后ID/IG：0.96；AChE固定化后ID/IG：0.96；裸SPGE Rct：1.9 kΩ；石墨烯修饰Rct：0.9 kΩ；G + CNF修饰Rct：0.6 kΩ；AChE固定化后Rct：0.8 kΩ；电极重复数：n = 3
3.2 电化学传感性能
为进一步评估所开发传感平台的适用性，研究了代表性的有机磷和氨基甲酸酯农药（图S5）。所有测试农药均表现出浓度依赖性抑制响应，表明传感机制基于乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制，适用于更广泛的AChE抑制类农药。在研究化合物中，对氧磷因其明确的抑制机制、高急性毒性和作为AChE基生物传感器研究中基准化合物的广泛使用，被选为详细优化和分析评估的模型分析物。所有测量均进行重复（n = 5），整合误差棒和相对标准偏差以量化重现性。
【数据】重复测量次数：n = 5
#### 3.2.1 灵敏度测试
对于电化学传感器，用于样品吸收的CNF含量在0至0.5%wt.范围内调整。结果（图3a）表明电流信号随CNF量增加呈下降趋势，归因于CNF的非导电性质，因此选择0.025%wt.浓度用于进一步电极修饰。此外，如图3b所示，分析信号随AChE酶浓度升高而增加，但在过高浓度时下降。因此，最佳AChE浓度确定为2 units/mL。通过监测0.1 ppm对氧磷溶液中AChE活性，评估了孵育时间对酶抑制的影响，如图3c所示。在前10 min内观察到酶活性快速下降，反映了两步反应机制。第一步中，AChE被对氧磷抑制，5 min孵育时间足以允许有效的酶-抑制剂相互作用。随后额外5 min对应于与ATCh底物的酶反应。因此，实现完整可测量响应所需的总反应时间为10 min。于是，选择10 min孵育时间作为可靠电化学测量的最佳条件。优化孵育时间后，通过固定孵育时间为10 min并改变对氧磷浓度，进一步检查了AChE酶的抑制行为。如图3c所示，AChE修饰电极的抑制百分比随对氧磷水平增加而增加，确认了酶的浓度依赖性抑制动力学。电流与对氧磷浓度的校准曲线如图3e所示。修饰电极在0–1.0 ppm范围内氧化电流与对氧磷浓度之间表现出清晰的线性关系，遵循良好线性方程y = −2.4827x + 3.2233，相关系数R² = 0.97。线性表明该生物传感器通过对氧磷提供可靠和定量的检测。
【数据】CNF浓度范围：0–0.5%wt.；最优CNF浓度：0.025%wt.；最优AChE浓度：2 units/mL；对氧磷浓度（孵育时间优化）：0.1 ppm；孵育时间：10 min（5 min抑制 + 5 min酶反应）；线性范围：0–1.0 ppm；线性方程：y = −2.4827x + 3.2233；R² = 0.97；重复次数：n = 5
讨论与解读
本研究成功开发了一种便携式双模态生物传感平台，用于检测AChE抑制类农药，以对氧磷为代表性模型分析物。该平台将石墨烯/CNF修饰电极与纸基比色条集成，通过乙酰胆碱酯酶抑制实现同时电化学定量和视觉筛查。CNF基纳米复合物提供了高表面积和生物相容性基质，用于稳定酶固定化和高效电子传递，实现了0–1.0 ppm的线性检测范围、86 ppb的检出限和良好的储存稳定性（10天后活性>80%）。机器学习辅助分析作为补充工具，用于评估优化传感条件下获得的电化学响应的一致性。在加标水果和水样中的验证证明了所开发平台在实际样品中快速筛查农药污染的实际适用性。总体而言，这些结果突出了将纤维素纳米纤维基生物传感、便携式电子设备和数据驱动分析相结合用于未来食品安全和环境监测应用的潜力。
编译者解读
该研究的方法学亮点在于将CNF的双重功能——酶固定化基质与毛细管吸样——整合于单一材料，简化了便携式器件的流体操控需求。机器学习模块的引入并非替代分析化学，而是用于解卷积复杂基质中的响应信号，这在现场检测场景中具有实用价值。然而，研究仍存在局限：数据集仅39个原始样本，增强后的模型泛化能力需在更多真实样本中验证；比色阈值0.5 ppm的灵敏度对于严格法规限值可能不足。未来可探索CNF表面功能化以提升酶负载量和抗干扰能力。
参考来源
期刊：International Journal of Biological Macromolecules, 2026
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.153624
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.153624