来源：Isolation, identification, and quantum chemical analysis of structure-activity relationships of antioxidant peptides from sesame meal via Aspergillus niger fermentation and flavourzyme hydrolysis（Food Research International）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
芝麻粕是芝麻油加工的主要副产物，年产量约100万吨，蛋白含量高达40%，却长期被低值化利用。本研究构建了"黑曲霉发酵+风味酶水解"的集成策略：以碱性蛋白酶解大豆肽（A-SPIH）作为发酵促进剂，将黑曲霉产蛋白酶的高峰期从第7天提前到第3天；在pH 4.0、50 °C、20 h条件下水解，肽产率和抗氧化活性同时达到最高；200 Da～2 kDa组分活性最强，并经生物信息学筛出6条新肽，用量子化学计算锁定Trp吲哚C、Tyr酚羟基O和Met硫原子为关键活性位点。
研究背景
氧化应激是衰老和慢性病发展的重要推手，外源补充安全有效的抗氧化剂对维持细胞氧化还原平衡至关重要。抗氧化肽能清除自由基、缓解氧化损伤，在延缓衰老和促进健康方面发挥作用。相比合成抗氧化剂，植物源抗氧化肽原料来源广、安全性高、环境友好，正逐步成为食品与化妆品行业的功能配料替代方案。植物肽可来自谷物、豆类、油料副产物、坚果和蔬菜，其中油料加工副产物因产量大、蛋白含量高而备受关注。芝麻粕正是典型代表——年产量约100万吨，蛋白含量可达40%，是制备抗氧化肽的优质原料，有望推动芝麻粕的高值化利用。酶解和微生物发酵是制备抗氧化肽的常用手段，本研究将两者整合，并引入量子化学手段解析构效关系。
研究方法
2.1 材料
芝麻粕（蛋白含量45.11%）由山东十里香芝麻制品股份有限公司（中国滨州）提供。高产蛋白酶黑曲霉（菌株编号：CCTCC AF 2014010）购自中国典型培养物保藏中心（中国武汉）。大豆分离蛋白（SPI，纯度90.5%）和Sephadex G-15购自上海源叶生物科技有限公司（中国上海）。Flavourzyme、Alcalase和Neutrase（4000 U/g）均购自诺维信（中国）生物技术有限公司（中国天津）。其他试剂均为分析纯。
【数据】芝麻粕蛋白含量：45.11%；SPI纯度：90.5%；酶活力：4000 U/g；黑曲霉菌株编号：CCTCC AF 2014010
2.2 芝麻粕的发酵-酶解
#### 2.2.1 SPIH的制备
将10.0 g SPI均匀分散于80 mL去离子水中，分别在特定温度和pH条件下用不同蛋白酶水解3 h（Cao et al., 2024）。不同蛋白酶的添加量和反应条件见表1。随后将体系在100 °C加热15 min使酶失活。混合物以3000 ×g离心10 min，收集上清液，得到不同的水解物，分别命名为F-SPIH、A-SPIH和N-SPIH。
【数据】SPI用量：10.0 g；去离子水：80 mL；水解时间：3 h；灭活温度：100°C；灭活时间：15 min；离心：3000 ×g、10 min
#### 2.2.2 不同发酵芝麻粕的制备
将黑曲霉斜面培养基刮入5 mL灭菌NaCl溶液（0.8%，w/v）中，获得黑曲霉孢子悬液。将黑曲霉孢子悬液加入100 mL马铃薯葡萄糖肉汤中培养30 h，获得黑曲霉种子培养液（每100 g含10⁵个孢子）。每份芝麻粕（50.0 g）与10%（w/w）葡萄糖溶液（50 mL）混合，分别加入1 mL F-SPIH、A-SPIH和N-SPIH。混合物灭菌（121 °C，20 min），接种5 mL黑曲霉种子培养液，在28 °C发酵24～120 h，获得不同的发酵芝麻粕。不含SPIH的发酵芝麻粕在28 °C培养5～9天后作为对照组。
【数据】NaCl浓度：0.8%（w/v）；孢子悬液体积：5 mL；PDB体积：100 mL；种子培养时间：30 h；孢子浓度：10⁵个/100 g；芝麻粕：50.0 g；葡萄糖：10%（w/w）、50 mL；SPIH添加量：1 mL；灭菌：121°C、20 min；接种量：5 mL；发酵温度：28°C；发酵时间：24–120 h
#### 2.2.3 发酵芝麻粕产物的制备
将黑曲霉培养4天的发酵芝麻粕与去离子水按1:8（w/v）混合，按蛋白酶与底物比1.5‰（w/w）加入Flavourzyme。将体系pH调节至3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，然后在40 °C～60 °C下酶解12 h～28 h（图1）。此举使黑曲霉分泌的蛋白酶与外加Flavourzyme持续水解芝麻粕。随后在100 °C加热15 min使酶失活；但若水解物用于酶活测定，则无需此加热步骤。混合物冷却至室温，以3000 ×g离心10 min，收集上清液即为发酵芝麻粕产物。
【数据】发酵时间：4天；料液比：1:8（w/v）；酶底比：1.5‰（w/w）；pH：3.0–7.0；温度：40–60°C；酶解时间：12–28 h；灭活：100°C、15 min；离心：3000 ×g、10 min
2.3 发酵芝麻粕中蛋白酶活力的测定
蛋白酶活力测定程序参照中国国家标准（GB/T 23527.1–2023）及Tian、Feng、Zhao和Su（2022）所述方法，并稍作修改。具体而言，将0.40 g发酵芝麻粕分别与10 mL乳酸钠缓冲液（0.05 M，pH 3.0）或10 mL磷酸盐缓冲液（0.05 M，pH 7.5）混合。混合物搅拌1 h以促进酸性蛋白酶或中性蛋白酶从发酵芝麻粕中提取，随后以8000 ×g离心10 min。收集含酸性蛋白酶或中性蛋白酶的上清液。分别用0.05 M pH 7.5磷酸盐缓冲液和0.05 M pH 3.0乳酸钠缓冲液配制1%酪蛋白溶液，作为中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力测定的底物。将1 mL酸性蛋白酶溶液或中性蛋白酶溶液与酪蛋白溶液（1 mL）混合，在40 °C加热10 min。然后加入2 mL三氯乙酸（0.4 M），再次孵育（40 °C，10 min），随后过滤。在对照组中，蛋白酶溶液先与三氯乙酸混合，然后再加入酪蛋白溶液。制备由1 mL滤液、5 mL碳酸钠（0.4 M）和1 mL福林酚试剂组成的混合物，随后在40 °C孵育10 min。用紫外分光光度计（XLK2-220V10A，BioTek，美国）在680 nm处测定吸光度。根据标准曲线计算蛋白酶活力（图S1）。
【数据】发酵芝麻粕：0.40 g；缓冲液：10 mL、0.05 M、pH 3.0/7.5；搅拌：1 h；离心：8000 ×g、10 min；酪蛋白：1%；孵育：40°C、10 min；三氯乙酸：2 mL、0.4 M；碳酸钠：5 mL、0.4 M；福林酚：1 mL；检测波长：680 nm
2.4 水解度（DH）和分子量分布的测定
测定发酵芝麻粕产物的水解度（DH），其通过水解过程中为保持pH恒定而加入的0.1–1 M NaOH的量计算（Rios-Herrera et al., 2021）。分子量分布采用HPLC-SEC分析，使用Agilent Technology（美国）infinity系统，配备TSK gel 2000 SWXL（300 × 7.8 mm，Tosoh，日本东京）色谱柱。色谱柱用45%（v/v）乙腈和0.1%（v/v）三氟乙酸缓冲液平衡并洗脱，流速0.5 mL/min。进样10 μL，用紫外检测器监测214 nm处吸光度。
【数据】NaOH浓度：0.1–1 M；乙腈：45%（v/v）；三氟乙酸：0.1%（v/v）；流速：0.5 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：214 nm
2.5 肽产率的测定
可溶性肽含量采用Magalhães、Guimarães、Tribst、Oliveira和Leite Júnior（2022）报道的三氯乙酸（TCA）法测定，稍作修改。简要而言，将5 mL样品与5 mL TCA（10%，w/v）混合后离心（4000 rpm，10 min）。然后取上清液（6 mL）与4 mL双缩脲试剂混合，双缩脲试剂由10%（w/v）NaOH溶液（2.4 mL）和1%（w/v）CuSO₄溶液（1.6 mL）组成。室温孵育10 min后，混合物以4000 ×g离心10 min。测定上清液在540 nm处的吸光度。根据标准曲线计算蛋白含量。肽产率% = 上清液中肽含量 / 样品中总蛋白含量 × 100%。样品中总蛋白含量按Noh（2022）所述凯氏定氮法分析。粗蛋白含量（g/100 g）由测得的总氮含量（以每100 g干基氮表示）乘以6.25的氮-蛋白换算系数计算。
【数据】样品：5 mL；TCA：5 mL、10%（w/v）；离心：4000 rpm、10 min；上清液：6 mL；双缩脲试剂：4 mL；NaOH：2.4 mL、10%（w/v）；CuSO₄：1.6 mL、1%（w/v）；室温孵育：10 min；离心：4000 ×g、10 min；检测波长：540 nm；氮-蛋白换算系数：6.25
2.6 超滤分离
发酵芝麻粕产物依次经微滤（200 nm陶瓷膜）分离，随后用截留分子量为5 kDa、2 kDa和200 Da的超滤膜（DMJ60–2，山东博纳生物科技集团有限公司，中国）进行超滤。该过程根据分子大小得到五个不同组分：F1（>200 nm）、F2（200 nm～5 kDa）、F3（2 kDa～5 kDa）和F4（200 Da～2 kDa）。F1至F4分别收集，在−80 °C冷冻干燥48 h获得粉末。
【数据】微滤膜：200 nm；超滤截留分子量：5 kDa、2 kDa、200 Da；冻干温度：−80°C；冻干时间：48 h
2.7 凝胶过滤色谱纯化
选择Sephadex G-15对F4（200 Da～2 kDa）进行进一步肽分离。将10 mg/mL F4溶液（F4粉末分散于去离子水中）通过0.45 μm滤膜，取2 mL滤液加入色谱柱（1.6 cm × 60 cm，佳鹏科技有限公司，中国）。用去离子水以1 mL/min流速洗脱。使用核酸蛋白检测仪（DH-2000，佳鹏科技有限公司，中国）在280 nm处检测到三个色谱峰，分别命名为F4-A、F4B和F4C。收集相应组分并冷冻干燥。
【数据】F4浓度：10 mg/mL；滤膜：0.45 μm；上样量：2 mL；色谱柱：1.6 cm × 60 cm；流速：1 mL/min；检测波长：280 nm
2.8 抗氧化活性测定
#### 2.8.1 羟自由基清除活性
羟自由基清除活性采用水杨酸法测定（Ge et al., 2021）。将等体积的样品溶液、5 mM硫酸亚铁、5 mM水杨酸溶液和H₂O₂（0.1%，w/v）溶液混合，在37 °C孵育30 min。在510 nm处测定吸光度，记为A1。对照组中用去离子水替代H₂O₂（0.1%，w/v）溶液。
【数据】硫酸亚铁：5 mM；水杨酸：5 mM；H₂O₂：0.1%（w/v）；孵育：37°C、30 min；检测波长：510 nm
研究结果
3.1 SPIH对发酵芝麻粕中蛋白酶活力和肽产率的影响
蛋白酶活力是黑曲霉在发酵过程中产蛋白酶的水解能力和生长状态的指标，因此必须监测。在不含SPIH的发酵芝麻粕中（图2A），酸性蛋白酶活力在5～9天内始终高于中性蛋白酶活力。酸性蛋白酶活力在第8天达到最大值（1634.49 U/g），而中性蛋白酶活力最大值出现在第7天（616.39 U/g）。添加A-SPIH后（图2B），最高蛋白酶活力出现在发酵第3天，中性蛋白酶达634.14 U/g，酸性蛋白酶达1532.04 U/g。发酵3天后，蛋白酶活力即达到不含SPIH发酵7天后的水平。这表明A-SPIH促进了黑曲霉生长，从而显著缩短了发酵周期。这一效应可能归因于蛋白质作为氮源支持微生物生长（Cao et al., 2024），生成的小肽更易被菌株利用。类似地，Seguinot等（2018）报道氮源补充（包括铵态氮和有机氮源）可加速发酵并缩短发酵时间。Yang、Zong、Cui、Mu和Zhao（2018）发现，用胰酶制备的富含肽的有机氮——小麦面筋水解物——增强了酿酒酵母的生长和代谢活性。尽管F-SPIH和N-SPIH在第1天导致中性蛋白酶活力高于同日的不含SPIH样品，但随着发酵进行该活力未进一步增加（图2C、D）。而且第5天的酸性蛋白酶活力低于同日的不含SPIH样品。如图S2所示，A-SPIH的水解度高于F-SPIH和N-SPIH，表明肽组成和氨基酸序列不同（Zhang, Ma et al., 2025；Cai et al., 2025），这可能影响了氮源可利用性和黑曲霉的酶合成。图S3和表S1显示，A-SPIH中66.51%的肽<500 Da。相比之下，N-SPIH和F-SPIH中<500 Da肽的比例低得多（分别为19.46%和17.56%），而两者均含有可检测的>10 kDa肽（N-SPIH为7.76%，F-SPIH为7.22%）。N-SPIH和F-SPIH保留了更多大肽，N-SPIH以3–1 kDa肽为主（32.97%），而F-SPIH在10–3 kDa（28.03%）和3–1 kDa（26.82%）之间分布更均衡，进一步凸显了三个样品间肽谱的差异。这些发现表明，含更多小肽的A-SPIH在促进黑曲霉发酵产蛋白酶方面更有效。Liu、Lu、Li、Zheng和Liu（2026）报道植物源小肽（黑豆、大豆肽、人参和小麦肽）影响浑浊红球菌的生长和脂质积累，并观察到氨基酸谱与氮利用效率之间的相关性。SPIH的添加也影响了肽产率。如图2E所示，不含SPIH样品的肽产率先升高后趋于稳定，在第7天达到最高值（32.2%）。图2F显示，A-SPIH组的肽产率在整个发酵过程中始终高于F-SPIH和N-SPIH组。此外，F-SPIH和N-SPIH未显著增强蛋白酶活力（图2C、D），这与相同发酵时间下较低的肽产率一致（图2E、F）。具体而言，第5天不含SPIH组的肽产率达20.82%，而F-SPIH和N-SPIH组的相应值分别为18.53%和19.83%。结合图2B的结果，A-SPIH不仅促进了黑曲霉在芝麻粕发酵中的蛋白水解活性，还提高了肽产率。
【数据】不含SPIH酸性蛋白酶活力峰值：1634.49 U/g（第8天）；中性蛋白酶活力峰值：616.39 U/g（第7天）；A-SPIH组第3天中性蛋白酶：634.14 U/g、酸性蛋白酶：1532.04 U/g；A-SPIH <500 Da肽比例：66.51%；N-SPIH <500 Da：19.46%；F-SPIH <500 Da：17.56%；N-SPIH >10 kDa：7.76%；F-SPIH >10 kDa：7.22%；N-SPIH 3–1 kDa：32.97%；F-SPIH 10–3 kDa：28.03%、3–1 kDa：26.82%；不含SPIH肽产率峰值：32.2%（第7天）；第5天肽产率：不含SPIH 20.82%、F-SPIH 18.53%、N-SPIH 19.83%
3.2 酶解条件对肽产率、水解度和抗氧化活性的影响
黑曲霉发酵产生的蛋白酶主要为酸性蛋白酶（图2），其在酸性pH下具有最佳催化活性。为在后续水解步骤中保持持续协同的蛋白水解，需选择pH活性范围相近的外源蛋白酶。Flavourzyme同时含有内肽酶和外肽酶活性，被选为补充酶，与黑曲霉产生的蛋白酶联合水解芝麻粕蛋白。如图3所示，水解条件显著影响肽产率、水解度和抗氧化活性。随着pH和温度升高，肽产率和水解度（DH）均先升高后降低（图3A和B）。相反，随着时间延长，肽产率和DH先升高后达到平台（图3C）。在最优条件下（pH 4.0、50 °C和20 h），发酵芝麻粕产物表现出最高肽产率。随着水解pH、温度和时间增加，羟自由基清除活性、DPPH自由基清除能力和铁离子还原力均先升高后降低（图3D～F）。在pH 4.0、50 °C、20 h条件下获得的发酵芝麻粕产物表现出最强抗氧化活性，羟自由基清除活性64.82%，DPPH自由基清除能力82.10%，铁离子还原能力0.48。类似地，Zhang、Zang、Gao、Chen和Tong（2025）报道pH、温度和孵育时间影响乳酸菌的酶活性，从而影响发酵辅助酶解制备的蛋清肽的抗氧化活性。因此，利用黑曲霉发酵产生的蛋白酶与补充的Flavourzyme联合作用，生产具有最高抗氧化活性和肽产率的发酵芝麻粕产物的最优条件为pH 4.0、50 °C、20 h。
【数据】最优条件：pH 4.0、50°C、20 h；羟自由基清除活性：64.82%；DPPH自由基清除能力：82.10%；铁离子还原能力：0.48
3.3 抗氧化芝麻肽的分离、纯化与表征
为鉴定负责抗氧化活性的肽组分并阐明分子特征与生物活性之间的关系，将发酵芝麻粕产物经超滤和凝胶过滤色谱分离，并评估不同组分的抗氧化活性。如图4A所示，超滤分级（F1～F4）显著改变了抗氧化活性分布。F1、F2和F3的抗氧化活性均低于未分级的发酵芝麻粕产物（对照）。相反，F4组分表现出更高的DPPH自由基清除能力（93.54%）、羟自由基清除活性（73.59%）和铁离子还原能力0.525。总体而言，200 Da～2 kDa的F4表现出最高抗氧化活性。该结果与Chen等（2022）和Ma、Guo、Fu和Jin（2020）的报道一致，较小的肽具有更高的抗氧化活性。选择F4通过凝胶过滤色谱进一步纯化以分离关键抗氧化肽，分别收集F4-A、F4B和F4C（图4B）。如图4C所示，F4-A、F4B和F4C的DPPH自由基清除能力分别为36.99%、56.35%和82.25%，从F4-A到F4C呈明显递增。类似地，F4C表现出最强的羟自由基清除活性（83.14%），显著高于（p < 0.05）F4-A（56.66%）和F4B（53.32%）。此外，F4C的铁离子还原力也显著……
【数据】F4 DPPH清除能力：93.54%；F4羟自由基清除活性：73.59%；F4铁离子还原能力：0.525；F4-A/F4B/F4C DPPH清除能力：36.99%/56.35%/82.25%；F4C羟自由基清除活性：83.14%（p < 0.05）；F4-A：56.66%；F4B：53.32%
3.4 生物信息学筛选与量子化学分析
基于非毒性、水溶性、高肽评分、稳定性、疏水性和预测活性，生物信息学筛选进一步选出105条潜在抗氧化肽。PDGWGP、DAPWGPH、GGPYGMR、DPYGPP、GGYGGPR和PDYHP作为新抗氧化肽，通过量子化学方法分析以阐明其抗氧化活性位点。HOMO-LUMO能隙和Fukui函数分析表明，Trp的吲哚基团C、Tyr的酚羟基O、Met的S是所选抗氧化肽的主要活性位点。去除这些活性位点导致体外抗氧化活性显著下降。
【数据】筛选潜在抗氧化肽：105条；选定新肽：PDGWGP、DAPWGPH、GGPYGMR、DPYGPP、GGYGGPR、PDYHP；关键活性位点：Trp吲哚C、Tyr酚羟基O、Met硫原子
讨论与解读
本研究采用"黑曲霉发酵+Flavourzyme水解"集成策略，从芝麻粕中分离鉴定抗氧化肽。碱性蛋白酶解大豆肽（A-SPIH）增强了蛋白水解活性并缩短了黑曲霉芝麻粕发酵周期。在黑曲霉自身蛋白酶与外加Flavourzyme的共同作用下，pH 4.0、50 °C、20 h时抗氧化活性和肽产率同时达到最高。超滤与凝胶过滤显示200 Da～2 kDa肽段抗氧化活性最强。生物信息学基于非毒性、水溶性、高肽评分、稳定性、疏水性和预测活性筛出105条潜在抗氧化肽，并选定PDGWGP、DAPWGPH、GGPYGMR、DPYGPP、GGYGGPR和PDYHP六条新肽进行量子化学分析。HOMO-LUMO能隙与Fukui函数分析表明，Trp吲哚基团的C、Tyr酚羟基的O和Met的S是主要活性位点，去除这些位点后体外抗氧化活性显著下降。该研究为芝麻粕抗氧化肽开发提供了新思路并揭示了原子级机制，展示了其作为天然抗氧化剂的潜力；但原文指出，仍需进一步临床试验进行评价。
编译者解读：该工作的亮点在于"发酵促进剂+外源酶"的时序协同设计——用A-SPIH把产酶高峰从第7天拉到第3天，再让酸性蛋白酶与Flavourzyme在pH 4.0下接力水解，避免了pH错配导致的效率损失。量子化学把活性位点精确到Trp吲哚C、Tyr酚羟基O和Met硫原子，为后续定向改造肽序列提供了可操作的靶点。局限也明显：全部证据停留在体外化学 assay，缺乏细胞和体内验证，且105条候选肽仅验证了6条，覆盖面有限。
参考来源
期刊：Food Research International, 2026
DOI: 10.1016/j.foodres.2026.119875
DOI: 10.1016/j.foodres.2026.119875