来源：Novel R2R3-MYB transcription factor CsMYB39 influences epigallocatechin gallate biosynthesis in tea plant (Camellia sinensis) by regulating CsSCPL11-IA gene expression（Industrial Crops and Products）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是茶树中生物活性最强的没食子酰化儿茶素，其合成受转录因子精密调控。本研究以EGCG合成关键酶基因CsSCPL11-IA的启动子为诱饵，利用酵母单杂交技术筛选并鉴定了一个全新的R2R3-MYB转录因子CsMYB39。该基因定位于细胞核，瞬时过表达使茶树叶片总儿茶素含量提高0.28倍、EGCG提高0.64倍；病毒诱导基因沉默后儿茶素和EGCG含量分别下降79%和71%。双荧光素酶报告、凝胶迁移和酵母单杂交实验证实CsMYB39直接结合CsSCPL11-IA启动子特定区域并强激活其转录。该研究为茶树分子育种改良品质提供了新基因资源。
研究背景
茶树（Camellia sinensis (L.) O. Kuntze）是中国重要的多年生经济作物，兼具文化、经济和健康价值。儿茶素是茶叶中主要的类黄酮成分，占干重的12–24%、占茶多酚总量的70%以上，是决定茶叶独特风味与健康功效的核心物质基础。EGCG是茶树中含量最丰富、生物活性最强的没食子酰化儿茶素，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和心血管保护等生理功能，因而成为茶叶品质改良的重要靶标。
儿茶素的生物合成是一个涉及多途径、多步骤、多酶协同催化的复杂过程，依次通过莽草酸途径、苯丙烷途径和黄酮途径完成，形成高度精确的代谢调控网络。莽草酸途径是连接植物初生代谢与次生代谢的关键桥梁，为儿茶素合成提供苯丙氨酸等芳香族氨基酸前体。苯丙烷途径由苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸4-羟化酶等酶催化。转录因子在该网络中扮演精密调控角色，其中R2R3-MYB家族是植物类黄酮代谢调控的重要成员。然而，调控EGCG合成的转录因子及其分子机制仍有待深入解析。
研究方法
2.1 植物材料
选用三年生茶树品种'乌牛早'（具有高遗传转化效率）和'福鼎大白'（广泛栽培的茶树品种）幼苗作为所有涉及茶树实验的材料。这些品种来源于贵州大学位于贵阳（中国贵州省）的茶园（26°24′ N, 106°11′ E，平均海拔1132 m）。此外，本氏烟草（Nicotiana benthamiana）幼苗叶片用于双荧光素酶表达和亚细胞定位实验。所有幼苗均在贵州大学茶学院温室中培养，培养条件受控（白天16 h为25 ℃，夜间8 h为18 ℃）。新鲜样品在采收后直接分析，或在液氮中速冻后于−80 °C保存备用。
【数据】材料：三年生'乌牛早'和'福鼎大白'茶树幼苗、本氏烟草幼苗；产地坐标：26°24′ N, 106°11′ E；海拔：1132 m；培养温度：白天25 ℃/夜间18 ℃；光周期：16 h光照/8 h黑暗；保存温度：−80 °C
2.2 候选基因筛选
本研究所用cDNA文库由GenScript Biotech Corporation定制构建。起始材料包括'福鼎大白'茶树的芽、幼叶、成熟叶和根。构建流程遵循GenScript标准cDNA文库构建方案：提取总RNA，通过Oligo(dT)亲和层析纯化mRNA，经反转录合成双链cDNA，连接合适接头后重组入质粒载体，最后转化建立质粒cDNA文库。采用Y1H技术筛选候选基因。将获得的重组质粒pAbAi-CsSCPL11-IA线性化后转化Y1HGold酵母感受态细胞，涂布于缺尿嘧啶的合成定义培养基（SD/−Ura）上。菌落生长表明线性化诱饵质粒已成功导入宿主细胞且对宿主无毒。将空 prey 质粒pGADT7转化入含诱饵质粒的感受态细胞，分别涂布于SD/−Leu和SD/−Leu/AbA平板。结果显示SD/−Leu/AbA平板（含100 ng/mL AbA）上无菌落生长，表明AbA最低抑制浓度为100 ng/mL。诱饵质粒未激活报告基因AbAr表达，宿主细胞对AbA无抗性，故无法在这些平板上生长。随后采用100 ng/mL AbA进行筛选实验。从SD/−Ura平板上挑取单菌落，在液体SD/−Ura培养基中振荡培养至OD600达0.6–0.8。用无菌水洗涤细胞，重悬于0.1 M TE/LiAc溶液（Solarbio, 北京, 中国）制备酵母感受态细胞。将感受态细胞与文库质粒、载体DNA和LiAc/PEG混合，30 °C孵育，42 °C热激，离心收集，重悬于YPD Plus培养基（酵母提取物/蛋白胨/葡萄糖）。将细胞悬液梯度稀释后涂布于SD/−Leu和SD/−Leu/AbA平板。30 °C培养3天后计数菌落，计算筛选文库大小。挑取SD/−Leu/AbA平板上的阳性菌落，进行多轮划线纯化验证其对AbA的抗性。将验证的阳性克隆接种于SD/−Leu/AbA液体培养基中过夜培养。使用酵母质粒小提试剂盒提取质粒。以通用引物T7和3AD进行PCR扩增，总反应体积20 μL，20个循环。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析。显示阳性条带的样品送测序，测序结果经BLAST分析（补充表1）鉴定目标基因。
【数据】培养基：SD/−Ura、SD/−Leu、SD/−Leu/AbA、YPD Plus；AbA浓度：100 ng/mL；OD600：0.6–0.8；TE/LiAc浓度：0.1 M；热激温度：42 °C；培养温度：30 °C；培养时间：3天；PCR反应体积：20 μL；循环数：20
2.3 CsMYB39亚细胞定位与异源过表达
亚细胞定位实验：首先从茶树叶片cDNA中克隆CsMYB39全长序列，插入GFP表达载体pCAMBIA2301，获得融合构建体35S-CsMYB39-GFP，随后转化根癌农杆菌GV3101菌株，空载体pCAMBIA2301-GFP作为阴性对照。p2300–35S-NLS-mCherry作为核定位标记。将农杆菌悬浮液缓慢注射入本氏烟草叶片。注射农杆菌悬浮液48 h后进行亚细胞定位观察。将注射的烟草叶片切片，按照Zeiss LSM900（ZEISS Group）激光共聚焦显微镜操作说明观察荧光信号（激发光源：GFP 488 nm，mCherry/RFP 560–610 nm；强度：5–20%；采集带宽：GFP 500–550 nm，mCherry/RFP 580–650 nm；增益：500–700）。
烟草（Nicotiana tabacum L.）异源过表达采用农杆菌介导的叶盘法。烟草种子用75%乙醇和0.1%升汞表面消毒，播种于MS固体培养基（含3%蔗糖、0.8%琼脂，pH 5.8）。幼苗在25 ± 2 °C、16 h光照/8 h黑暗光周期下培养，随后移栽至灭菌营养土（蛭石:泥炭土 = 1:1）。将目标基因编码区克隆入植物双元表达载体pCAMBIA2301。序列验证后，采用冻融法将重组质粒转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞。阳性克隆在YEB液体培养基（补充利福平和卡那霉素）中28 °C振荡培养至OD₆₀₀达0.6–0.8。离心收集菌体，重悬于含100 μmol/L乙酰丁香酮的MS液体培养基中至OD₆₀₀为0.5，室温活化2–4 h。取4–6周龄烟草健康叶片表面消毒，切成约1 cm直径叶盘。叶盘浸入菌悬液10–15 min，用无菌滤纸吸干，远轴面朝下置于共培养培养基（MS + 乙酰丁香酮）。22–25 °C黑暗培养2–3天。共培养后将叶盘转移至筛选再生培养基（MS + 2.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA + 100 mg/L潮霉素 + 100 mg/L特美汀，pH 5.8）。外植体每2–3周继代一次以诱导抗性不定芽。当芽长至2–3 cm时切下转移至生根培养基（MS + 0.2 mg/L NAA + 100 mg/L潮霉素）。生根后移栽至营养土，收获T₀种子。T₀再生植株基因组DNA用载体特异性引物进行PCR鉴定。从确认的T₀株系获得阳性T₁种子，在含潮霉素的MS培养基上筛选，随后收集T₂种子。所有T₂植株均表现潮霉素抗性的株系鉴定为T₂转基因株系，用于后续基因功能分析。所有转基因材料在人工气候室中25 ± 2 °C、16 h光照/8 h黑暗光周期下培养。
【数据】载体：pCAMBIA2301、35S-CsMYB39-GFP、p2300–35S-NLS-mCherry；农杆菌菌株：GV3101；共聚焦参数：GFP激发488 nm，mCherry/RFP激发560–610 nm，强度5–20%，采集带宽GFP 500–550 nm/mCherry 580–650 nm，增益500–700；观察时间：注射后48 h；烟草种子消毒：75%乙醇+0.1%升汞；MS培养基：3%蔗糖、0.8%琼脂、pH 5.8；培养温度：25 ± 2 °C；光周期：16 h光照/8 h黑暗；营养土配比：蛭石:泥炭土=1:1；YEB培养温度：28 °C；OD₆₀₀：0.6–0.8（培养）/0.5（重悬）；乙酰丁香酮浓度：100 μmol/L；活化时间：2–4 h；叶盘直径：约1 cm；浸染时间：10–15 min；共培养温度：22–25 °C；共培养时间：2–3天；再生培养基：MS + 2.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA + 100 mg/L Hygromycin + 100 mg/L Timentin，pH 5.8；继代周期：2–3周；生根培养基：MS + 0.2 mg/L NAA + 100 mg/L Hygromycin
2.4 茶树VIGS实验
基因沉默实验以'乌牛早'茶树品种的CsMYB39为靶标进行VIGS。首先将适合VIGS的CsMYB39片段插入TRV2病毒载体构建pTRV2-CsMYB39载体（长沙科文生物技术有限公司）。随后将pTRV1、pTRV2和pTRV2-CsMYB39分别转化农杆菌GV3101化学感受态细胞（Bio-Transduction Lab, 武汉, 中国）。
【数据】茶树品种：'乌牛早'；载体：pTRV2-CsMYB39、pTRV1、pTRV2；农杆菌菌株：GV3101；载体构建公司：长沙科文生物技术有限公司；感受态细胞来源：Bio-Transduction Lab, 武汉, 中国
研究结果
3.1 茶树EGCG生物合成候选基因的筛选与鉴定
为筛选和鉴定调控EGCG合成的关键转录因子，我们利用Y1H技术成功分离并鉴定了CsMYB39基因。CsSCPL11-IA是EGCG合成的关键酶，以其启动子为诱饵筛选调控EGCG生物合成的转录因子。从'福鼎大白'品种基因组DNA中成功扩增CsSCPL11-IA启动子序列，构建诱饵质粒pAbAi-Pro-CsSCPL11-IA并经测序验证（图1A）。线性化后，诱饵质粒整合入Y1HGold酵母菌株，测定抑制诱饵菌株生长的最低AbA浓度为100 ng/mL（图1B）。随后将茶树cDNA文库转化入诱饵报告菌株，在含100 ng/mL AbA的SD/−Leu培养基上筛选阳性克隆（图1C）。PCR验证结果显示所有阳性克隆均含特异性插入片段（图1D）。Sanger测序和序列比对分析表明，一个阳性克隆编码的蛋白具有完整MYB DNA结合结构域。结构分析鉴定该基因为R2R3-MYB转录因子家族的新成员，命名为CsMYB39。对MYB39基因进行了生物信息学分析（补充图2）。
【数据】诱饵质粒：pAbAi-Pro-CsSCPL11-IA；酵母菌株：Y1HGold；AbA最低抑制浓度：100 ng/mL；筛选培养基：SD/−Leu + 100 ng/mL AbA；测序方法：Sanger测序；基因长度：1739 bp；编码氨基酸：328 aa
3.2 CsMYB39亚细胞定位、烟草异源过表达及其对类黄酮代谢的影响
CsMYB39基因全长1739 bp，编码328个氨基酸的蛋白。基于CELLO v2.5在线软件预测，CsMYB39定位于细胞核。为验证该预测，将融合表达载体pCAMBIA2301–35S-CsMYB39-GFP和空载体pCAMBIA2301–35S-GFP分别转化本氏烟草叶片。激光共聚焦显微镜观察显示，空载体的绿色荧光信号分布于细胞膜和细胞质，而CsMYB39-GFP融合蛋白的绿色荧光信号特异性定位于细胞核（图2A）。该结果证实CsMYB39是核定位蛋白，与转录因子执行DNA结合和转录调控功能的结构特征一致。
分析显示，三个代表性过表达株系（35S-CsMYB39–1、35S-CsMYB39–2、35S-CsMYB39–3）中CsMYB39转录水平显著高于野生型（WT）（P < 0.01）（图2B）。表型观察显示转基因烟草株系与WT在株高、叶形态和整体生长方面无显著差异（补充图3），表明CsMYB39过表达不影响烟草正常生长发育。由于烟草中儿茶素含量极低，通过测定类黄酮前体含量研究CsMYB39对类黄酮代谢的调控作用。结果显示，CsMYB39过表达显著促进烟草叶片中槲皮素、杨梅素、芦丁、二氢槲皮素和二氢杨梅素的积累（P < 0.05）。过表达株系中二氢槲皮素、二氢杨梅素和芦丁含量较WT分别增加25.3–38.6%、30.5–42.1%和28.7–40.3%（图2C–G）。这些结果表明CsMYB39能在异源植物中激活类黄酮生物合成途径并促进类黄酮前体积累，显示其在类黄酮代谢中具有保守的调控功能。
【数据】基因长度：1739 bp；编码氨基酸：328 aa；亚细胞定位：细胞核；过表达株系：35S-CsMYB39–1/2/3；CsMYB39表达量：显著高于WT（P < 0.01）；二氢槲皮素增加：25.3–38.6%；二氢杨梅素增加：30.5–42.1%；芦丁增加：28.7–40.3%；显著性：P < 0.05
3.3 CsMYB39调控茶树EGCG生物合成
为研究CsMYB39在茶树儿茶素生物合成中的调控功能，利用农杆菌介导的瞬时转化系统在茶树叶片中过表达CsMYB39（图3A），系统测定基因表达水平和儿茶素含量。RT-qPCR结果显示，35S-CsMYB39过表达株系中CsMYB39相对表达水平较WT上调约2.8倍（图3B），证实瞬时转化系统能高效实现CsMYB39高水平过表达。进一步测定各儿茶素单体和总儿茶素含量（图3C–K）发现，与WT相比，35S-CsMYB39过表达株系中8种儿茶素单体含量均显著增加（P < 0.05）。具体而言，儿茶素（C）含量增加0.21倍，表儿茶素（EC）增加0.16倍，没食子儿茶素（GC）增加0.5倍，表没食子儿茶素（EGC）增加0.57倍，儿茶素没食子酸酯（CG）增加0.08倍，EGCG增加0.64倍，表儿茶素没食子酸酯（ECG）增加0.61倍，没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）增加0.28倍。总儿茶素含量增加0.28倍（图3K）。在所有检测的儿茶素组分中，EGCG增幅最高，而C和CG增幅相对较低，表明CsMYB39对不同儿茶素组分具有差异化调控效应。总之，CsMYB39过表达能全面激活茶树儿茶素生物合成途径，显著促进各儿茶素单体和总儿茶素的积累。
为从反向遗传学角度进一步验证CsMYB39功能，采用病毒诱导基因沉默（VIGS）技术利用pTRV2载体沉默茶树中CsMYB39表达，系统检测下游结构基因表达和儿茶素含量变化（图4）。RT-qPCR结果显示（图4A），与pTRV2空载体对照相比，pTRV2-CsMYB39沉默株系中类黄酮生物合成途径多个关键结构基因（CsF3′5′H1、CsDFR、CsLAR、CsANR和CsSCPL11-IA）表达显著下调。儿茶素含量分析（图4B–K）显示，pTRV2-CsMYB39沉默株系总儿茶素含量较对照平均下降79%，各儿茶素单体均表现一致下降趋势：C下降35%，EC下降22%，GC下降19%，EGC下降55%，EGCG下降71%，ECG下降21.4%，GCG下降26.4%，CG下降50%。其中EGCG降幅最大，与过表达实验中观察到的差异化调控趋势一致（图3）。这些结果表明VIGS介导的CsMYB39沉默不仅在转录水平抑制下游结构基因表达，还在代谢水平导致各儿茶素单体和总儿茶素含量普遍下降。综合以上结果，CsMYB39被确认为茶树儿茶素生物合成途径的关键正调控转录因子。
【数据】CsMYB39过表达倍数：约2.8倍；C增加：0.21倍；EC增加：0.16倍；GC增加：0.5倍；EGC增加：0.57倍；CG增加：0.08倍；EGCG增加：0.64倍；ECG增加：0.61倍；GCG增加：0.28倍；总儿茶素增加：0.28倍；显著性：P < 0.05；沉默后总儿茶素下降：79%；C下降：35%；EC下降：22%；GC下降：19%；EGC下降：55%；EGCG下降：71%；ECG下降：21.4%；GCG下降：26.4%；CG下降：50%；下调基因：CsF3′5′H1、CsDFR、CsLAR、CsANR、CsSCPL11-IA
3.4 CsMYB39介导EGCG生物合成关键基因调控的分子机制
为研究CsMYB39与儿茶素生物合成关键结构基因的关联（图5A），本研究选取不同发育阶段的茶树新梢（包括嫩梢）进行分析。
【数据】分析材料：不同发育阶段茶树新梢；目标基因：儿茶素生物合成关键结构基因
讨论与解读
儿茶素生物合成是决定茶叶品质的核心代谢途径，其精准转录调控对茶叶风味和功能成分的形成至关重要。EGCG作为茶树中最重要的没食子酰化儿茶素，其调控机制长期是茶叶品质研究的焦点。本研究以EGCG合成关键酶基因CsSCPL11-IA的启动子区域为诱饵，筛选并鉴定了一个全新的R2R3-MYB转录因子CsMYB39，通过系统的体外和体内实验阐明了该新转录因子调控EGCG合成的功能角色及潜在机制。
Y1H技术是筛选与目标基因启动子互作转录因子的有效方法，已广泛应用于植物次生代谢调控基因的筛选。本研究成功鉴定CsMYB39与CsSCPL11-IA启动子的特异性互作，CsMYB39是R2R3-MYB转录因子家族的新成员。生物信息学分析显示CsMYB39具有典型MYB保守结构域且定位于细胞核，与转录因子的典型结构特征一致。
编译者解读
该研究采用"启动子诱饵-Y1H筛选-瞬转/沉默正反向验证-双荧光素酶/EMSA互作确认"的经典转录因子功能解析路线，逻辑链条完整。CsMYB39的发现为茶树EGCG定向调控提供了新的上游调控节点——通过操纵单个MYB转录因子即可实现EGCG含量0.64倍的提升或71%的下降，调控幅度可观。从合成生物学应用角度看，该模块（CsMYB39–CsSCPL11-IA）可作为茶树代谢工程的候选调控元件。局限在于：瞬转和VIGS均属瞬时调控，稳定转基因茶树的遗传效应及田间表现尚待验证；CsMYB39是否直接调控其他结构基因、是否存在翻译后修饰调控，文中未涉及。此外，过表达对C和CG的调控幅度较小，提示该转录因子对不同儿茶素分支的调控存在偏好性，其分子基础值得进一步探究。
参考来源
期刊：Industrial Crops and Products, 2026
DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.124251
DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.124251