来源：The Slt2-Swi6 signaling pathway plays a pivotal role in regulating cell wall biosynthesis, secondary metabolite production, and the pathogenicity of pear fungal A. alternata.（Virulence）| 编译：DNA Lab Space
导读
链格孢属真菌梨黑斑病菌（Alternaria alternata）可侵染百余种植物，其分泌的毒素与细胞壁降解酶是致病关键。本研究通过基因敲除技术，系统解析了细胞壁完整性（CWI）MAPK信号通路下游两个转录因子AaSwi6与AaMbp1的生物学功能。结果显示，二者共同调控菌丝生长、产孢、胁迫应答与致病力，但在细胞壁组分合成与毒素产生上呈现差异化调控。该研究为采后病害防控提供了新靶点。
研究背景
Alternaria alternata是一种广泛分布的植物病原真菌，可侵染超过100种植物，造成严重的经济损失。在侵染过程中，该真菌释放的霉菌毒素对人类健康构成严重威胁。链格孢毒素分为寄主特异性毒素（HSTs）和非寄主特异性毒素（nHSTs），其中以交链孢酚单甲醚（AME）、交链孢酚（AOH）、细交链孢菌酮酸（TeA）和腾毒素（TEN）最为常见。此外，病原真菌还分泌多种细胞壁降解酶（CWDEs），破坏植物结构完整性，增强致病力。
细胞壁完整性对真菌抵抗环境胁迫、有效侵入寄主组织至关重要。CWI MAPK信号通路通过激活下游转录因子Mbp1、Swi6和RlmA的表达，调控真菌细胞壁组装及相关毒力。然而，该通路在梨黑斑病菌中直接调控的转录因子此前尚未明确。本研究通过靶向基因敲除，阐明了两个转录因子AaSwi6和AaMbp1的功能。
研究方法
真菌菌株与培养条件
梨黑斑病菌野生型（WT）菌株分离自腐烂的“早酥”梨果实，通过16S rRNA测序鉴定。所有真菌菌株均在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上、28°C黑暗条件下培养。
*A. alternata*中AaMbp1与aaSwi6同源基因的鉴定
基于F. verticillioides Swi6和Mbp1的已表征蛋白序列，在NCBI数据库中进行BLAST搜索，获得A. alternata中这两个转录因子的蛋白序列。使用Clustal和MEGA 7.0软件构建不同真菌中这两个转录因子的系统发育树，分析不同真菌间的系统发育关系，并使用Conserved Domain Search在线工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）预测保守结构域。
基因敲除菌株的构建
为研究aaSwi6和aaMbp1在A. alternata中的功能，使用Premier 5.0设计靶向其编码序列的特异性引物。按照Li等人描述的方法构建靶基因敲除载体。采用聚乙二醇（PEG）介导的原生质体转化方法获得推定转化子。通过PCR扩增初步筛选，随后利用RT-qPCR分析转录水平进行验证。
表型测定
#### 菌丝生长、生物量积累与产孢
将各菌株的菌丝块接种到三种培养基上：完全培养基（CM）、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）和基本培养基（MM）。28°C黑暗培养5天后，拍照记录菌落形态，采用十字交叉法测量菌落直径。生物量测定：将各菌株接种于覆盖等重玻璃纸的PDA培养基上，28°C培养6天后称重。产孢测定：取2 µL各菌株孢子悬浮液点接于PDA平板，28°C培养6天。加入5 mL含0.01% Tween 80的无菌水溶液收获孢子，用血球计数板计数。
#### 侵染能力测定
参照Zhang等人建立的方法测定孢子萌发和附着胞样结构形成率。简要步骤如下：取20 µL孢子悬浮液置于GelBond疏水膜上，固定在载玻片上。样品在28°C、95%相对湿度下培养，3小时后统计孢子萌发率，6小时后统计附着胞样结构形成率。
#### 胁迫应答试验
将孢子悬浮液接种于添加不同胁迫化合物的PDA平板上：1 M NaCl、1 M山梨醇、200 μM刚果红、0.02%十二烷基硫酸钠（SDS）、50 μg/mL荧光增白剂（CFW）、5 mM H₂O₂或60 μM甲萘醌（MAD）。28°C培养5天后，采用十字交叉法测量菌落直径并拍照记录。
#### 细胞壁组分含量测定
参照Li等人的方法进行细胞壁组分分析。取0.1 g培养6天的PDA菌丝体，在磷酸盐缓冲液（PBS）中匀浆，12,000 rpm离心10分钟取上清。使用真菌几丁质ELISA试剂盒、真菌葡聚糖ELISA试剂盒和真菌甘露聚糖ELISA试剂盒测定含量。所有测定均设三次重复。几丁质可视化：孢子用CFW染色15分钟，在荧光显微镜下观察（Olympus，激发波长365 nm）。
#### DHN黑色素含量测定
胞外黑色素测定：将6个琼脂平板上的菌落（28°C黑暗培养6天）转移至100 mL PDB中，28°C、150 rpm振荡培养6天。培养滤液用7 M HCl调至pH 2.0。10,000 rpm离心15分钟后，完全弃去上清，获得粗黑色素提取物。随后向沉淀中加入7 M HCl，在沸水浴中水解2小时进一步纯化黑色素。再次离心去上清，沉淀溶于1 M NaOH中，重复酸碱纯化。最后用1 M NaOH定容至10 mL，以NaOH空白为参比，在400 nm处测定吸光度。黑色素浓度（mg/mL）按标准曲线方程y = (A₄₀₀ + 0.111) / 0.791计算。
胞内黑色素测定：过滤收集菌丝体，70°C干燥48小时。取0.25 g样品在30 mL 1 M NaOH中煮沸5小时，期间定期搅拌并补充体积。过滤后用NaOH定容至30 mL，测定400 nm处吸光度，黑色素含量（mg/g）按y = (A₄₀₀ + 0.0114)/0.0495计算。
#### 霉菌毒素含量测定
参照Wang等人的方法并稍作修改，从A. alternata菌丝体中提取霉菌毒素。取0.5 g在PDA上28°C黑暗培养6天的菌丝体，液氮冷冻研磨后转移至无菌离心管中。每份样品加入2.5 mL提取溶剂（乙腈:水:甲酸 = 4:0.997:0.003，v/v/v），28°C、150 rpm振荡30分钟。随后加入0.25 g无水MgSO₄和0.04 g NaCl，剧烈涡旋1分钟。10,000 rpm离心10分钟后，上清经0.22 μm有机相滤膜过滤，定容至1.2 mL，进行液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析。Agilent 6460三重四极杆质谱检测器配备电喷雾离子源，正离子模式（ESI+）运行。色谱定量使用商业霉菌毒素标准品，校准曲线及其他HPLC条件详见原文附表。
#### 角质酶、纤维素酶和β-葡萄糖苷酶活性测定
A. alternata CWDEs活性测定方法参照Li等人，收集0.1 g菌丝体，加入相应诱导培养基中。28°C、120 rpm摇床培养，分别于3、6、9天后过滤菌丝体，收集培养液。10,000 rpm离心30分钟，取上清作为待测粗酶液。
#### 致病力测定
致病性实验参照Moscoso-Ramírez等人的方法并稍作修改。选取大小均匀、无损伤的早酥梨、黄冠梨和番茄果实，用0.2%次氯酸钠表面消毒2分钟，无菌水充分冲洗后晾干。每个果实上用无菌打孔器制造3个等距伤口（直径3 mm）。
研究结果
*A. alternata*中AaSwi6与AaMbp1的鉴定
基于F. verticillioides的FvMbp1和FvSwi6蛋白序列，通过BLAST分析在A. alternata中鉴定出各自同源蛋白AaMbp1（29111150）和aaSwi6（29120169）。系统发育重建显示，A. alternata SRC1lrK2f的aaSwi6和AaMbp1蛋白与其在Pyrenophora tritici-repentis中的直系同源蛋白亲缘关系最近（图1A、B）。保守结构域分析表明，这两个转录因子均属于ANKYR超家族成员，并含有KilA-N结构域（图1C、D）。
【数据】BLAST鉴定同源蛋白：AaMbp1（ID: 29111150）；aaSwi6（ID: 29120169）；保守结构域：KilA-N + ANKYR超家族
AaMbp1与aaSwi6对*A. alternata*生长发育至关重要
为评估AaMbp1和aaSwi6在A. alternata发育中的作用，比较了WT、ΔaaSwi6和ΔAaMbp1菌株在PDA、MM和CM培养基上的生长特性。两个敲除突变体的菌落扩展均较WT减小，其中ΔAaMbp1的生长抑制比ΔaaSwi6更为明显。进一步分析显示，两个突变菌株的生物量积累和产孢量均显著降低（图2A–D）。为研究aaSwi6和AaMbp1对A. alternata侵染结构分化的影响，在疏水表面监测了分生孢子萌发和附着胞样结构形成。培养3小时后，ΔaaSwi6和ΔAaMbp1的萌发效率受损，其中ΔaaSwi6的缺陷更为严重。培养6小时后，两个突变体的附着胞样分化率均降低，ΔaaSwi6同样表现出更强的表型效应（图2E–F）。
【数据】培养温度：28°C；培养时间：5天（菌落）、6天（生物量/产孢）、3小时（萌发）、6小时（附着胞）；表型：ΔAaMbp1生长抑制更明显、ΔaaSwi6萌发与附着胞缺陷更严重
AaMbp1与aaSwi6参与*A. alternata*的胁迫应答
为评估突变体的胁迫应答特性，在不同胁迫条件下培养各菌株。ΔaaSwi6和ΔAaMbp1对细胞壁胁迫的敏感性略有增加，其中ΔAaMbp1对刚果红（38.64%）、CFW（19.91%）和SDS（31.38%）的抑制率最高，均超过WT（分别为29.72%、17.91%和31.10%）和ΔaaSwi6（分别为34.73%、18.81%和30.75%）。在渗透胁迫下，ΔAaMbp1对NaCl（54.8%）和山梨醇（6.8%）的抑制率最高，而WT对NaCl和山梨醇的抑制率分别为45.28%和−28.54%，ΔaaSwi6分别为44.47%和−5.75%。在氧化胁迫下，ΔAaMbp1对H₂O₂（12.18%）和MAD（38.41%）的抑制率最高，而WT分别为10.43%和33.46%，ΔaaSwi6分别为12.17%和35.4%。这些结果共同表明，aaSwi6和AaMbp1在维持细胞稳态中发挥重要作用（图3A–B）。
【数据】胁迫抑制率（ΔAaMbp1）：刚果红 38.64%、CFW 19.91%、SDS 31.38%、NaCl 54.8%、山梨醇 6.8%、H₂O₂ 12.18%、MAD 38.41%；WT对应值：29.72%、17.91%、31.10%、45.28%、−28.54%、10.43%、33.46%；ΔaaSwi6对应值：34.73%、18.81%、30.75%、44.47%、−5.75%、12.17%、35.4%；培养条件：28°C、5天
AaMbp1与aaSwi6参与*A. alternata*细胞壁组分合成
GPI锚定蛋白在真菌细胞壁多糖的生物合成和组织中发挥关键作用。本研究中，aaSwi6和AaMbp1的破坏导致编码GPI锚定蛋白的基因AaGPI1、AaGPI2和AaGPI3的转录显著下调（图4A）。几丁质合酶表达分析揭示了不同的调控模式：aaSwi6的缺失抑制了Aachs1、Aachs2、Aachs3、Aachs4、Aachs6、Aachs7b和Aachs8的转录，而AaMbp1的破坏下调了Aachs2、Aachs3、Aachs4、Aachs6和Aachs7a，同时上调了Aachs1、Aachs7b和Aachs8。几丁质含量定量分析表明，ΔaaSwi6和ΔAaMbp1突变体中的几丁质水平分别下降了24.47%和14.44%。CFW染色后的观察进一步证实了这些变化。
【数据】几丁质含量下降：ΔaaSwi6下降24.47%、ΔAaMbp1下降14.44%；培养条件：PDA、28°C、6天；差异显著性：Duncan多重比较检验，P < 0.05
AaSwi6与AaMbp1参与*A. alternata*次生代谢产物产生
黑色素含量测定结果显示，与WT相比，两个突变体的胞内和胞外黑色素含量均显著下降。DHN黑色素合成相关基因表达分析进一步验证了这一观察结果。霉菌毒素含量测定显示，与WT相比，ΔaaSwi6和ΔAaMbp1突变体中的AOH毒素水平分别降低了63.98%和86.32%，AME毒素水平分别降低了36.71%和82.85%，TeA毒素水平分别降低了33.28%和33%。相应毒素合酶相关基因的表达分析结果与毒素含量变化趋势一致。Velvet复合物合酶相关基因和聚酮合酶相关基因的表达也受到不同程度的影响（图5D–L）。
【数据】AOH毒素降低：ΔaaSwi6降低63.98%、ΔAaMbp1降低86.32%；AME毒素降低：ΔaaSwi6降低36.71%、ΔAaMbp1降低82.85%；TeA毒素降低：ΔaaSwi6降低33.28%、ΔAaMbp1降低33%；培养条件：PDA/PDB、28°C、6天
AaSwi6与AaMbp1参与*A. alternata*的致病性
将WT、ΔaaSwi6和ΔAaMbp1菌株接种早酥梨、黄冠梨和番茄果实后，测量病斑直径。两个突变体在所有寄主上的致病力均较WT显著降低。细胞壁降解酶活性测定显示，与WT相比，两个突变体的角质酶、纤维素酶和β-葡萄糖苷酶活性均有所下降，且相关合酶基因的表达也受到不同程度的影响（图6A–J）。
【数据】寄主：早酥梨、黄冠梨、番茄；测定时间点：5天（病斑）、10天（病斑）、3/6/9天（酶活）；致病力：突变体显著低于WT（P < 0.05）
AaSlt2与下游转录因子的物理互作
酵母双杂交实验证实，MAPK激酶aaSlt2与下游伴侣aaSwi6和AaRlmA存在物理互作，且aaSwi6还与AaMbp1和AaRlmA存在互作（图7I）。细胞壁组分分析显示，ΔaaSlt2突变体的几丁质、葡聚糖和甘露聚糖含量均下降，相关合酶基因表达也受到相应影响。此外，在ΔaaSlt2突变体中，AaRlmA、aaSwi6和AaMbp1的表达水平发生变化，表明aaSlt2对下游转录因子具有调控作用。
【数据】互作验证方法：酵母双杂交（Y2H）；培养基：DDO（缺Trp/Leu）、QDO（缺Trp/Leu/His/Ade）；阳性对照：pGBKT7-53/pGADT7-T；阴性对照：pGBKT7-Lam/pGADT7-T；培养时间：5天
讨论与解读
CWI MAPK信号级联在真菌中调控生长、胁迫适应、次生代谢和致病性。本研究中，MBF复合物基因aaSwi6和AaMbp1的单独敲除揭示二者共同参与调控A. alternata的生长、发育和致病性，同时对细胞壁合成和次生代谢产物产生具有差异化调控。两个转录因子均含有一个KilA-N结构域和多个ANK结构域，与F. verticillioides中FvMbp1和FvSwi6的N端APSES型DNA结合域加两个ANK结构域的结构特征一致，体现了该家族蛋白在真菌中的结构保守性。
毒素产量方面，突变体AOH、AME和TeA水平大幅下降，说明MBF复合物直接或间接调控毒素合成基因的表达。细胞壁组分分析揭示了两个转录因子的差异调控：aaSwi6的缺失同时降低几丁质、葡聚糖和甘露聚糖水平，而AaMbp1的缺失仅降低几丁质和甘露聚糖。酵母双杂交证实aaSlt2与aaSwi6/AaRlmA、以及aaSwi6与AaMbp1/AaRlmA之间的物理互作，为CWI信号通路的调控模型提供了直接证据。
编译者解读
本研究通过经典的基因敲除加表型回补策略，系统刻画了MBF复合物在链格孢致病中的双重角色——既管"墙"（细胞壁组分）又管"毒"（毒素合成）。从合成生物学应用角度看，aaSwi6和AaMbp1可作为采后病害防控的潜在分子靶点：若能设计针对这两个转录因子的特异性抑制剂或RNA农药，有望同时削弱病原菌的细胞壁完整性和毒素产生能力。值得关注的是，两个转录因子在细胞壁组分调控上的功能分化提示，联合靶向可能比单靶点策略更有效。不过，该研究主要基于体外和离体果实实验，田间条件下的防控效果仍需进一步验证。
参考来源
Li R, Liu Y, Li L, Zhang Y, Wang X. The Slt2-Swi6 signaling pathway plays a pivotal role in regulating cell wall biosynthesis, secondary metabolite production, and the pathogenicity of pear fungal A. alternata. Virulence. PMID: 42557790.
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