来源：Identification and functional validation of a beta-amyrin synthase for Clinopodiside A biosynthesis in medicinal plant Clinopodium chinense（Plant Science）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
风轮菜（Clinopodium chinense）是中药"断血流"的植物基原，其药理活性主要归因于齐墩果烷型三萜皂苷——风轮菜苷A。β-香树脂醇合酶（bAS）催化齐墩果烷型三萜生物合成的第一个关键步骤，但风轮菜苷A的生物合成遗传基础尚不清楚。本研究通过对风轮菜十个组织及发育阶段的转录组进行WGCNA分析，鉴定到一个与风轮菜苷A积累高度相关的候选bAS基因CcbAS，并通过亚细胞定位、瞬时过表达和VIGS沉默三种策略完成了功能验证。
研究背景
风轮菜为唇形科植物，其干燥地上部分作为中药"断血流"入药，收载于《中国药典》（2025年版），以风轮菜苷A（Buddlejasaponin IVb）作为质量控制指标成分。现代药理学研究表明，风轮菜具有止血、抗炎、抗菌、抗病毒及促进子宫收缩等多种药理活性，这些活性主要归因于风轮菜苷A。已有研究证实含风轮菜苷A的复合止血海绵具有显著的促凝血活性，可明显缩短凝血时间；体外血小板聚集实验、TT实验及体内止血实验也进一步验证了其快速促凝作用。在抗炎机制方面，风轮菜苷A与芹菜素协同调节炎症信号通路及促性腺激素释放激素受体通路。
尽管风轮菜苷A的药理价值已获广泛认可，但其生物合成途径在很大程度上仍未被阐明。bAS催化2,3-氧化鲨烯环化生成β-香树脂醇，这是齐墩果烷型三萜皂苷生物合成的首个关键步骤。然而，在非模式药用植物中，风轮菜苷A生物合成的遗传基础研究极为有限。传统的差异表达分析往往产生数百个差异表达基因，难以优先筛选候选基因进行功能表征。加权基因共表达网络分析（WGCNA）通过整合代谢物数据与转录组数据，可将候选基因范围从数千个缩小至可控数量，已在多种非模式药用植物中成功应用。
研究方法
2.1 植物材料与生长条件
风轮菜植物材料种植于中国安徽省霍山县（31.03°N，115.52°E），由安徽农业大学袁艺教授进行分类学鉴定。6月和7月采集根、茎、叶，9月采集根、茎、叶、花。每种组织类型采集三个独立的生物学重复。新鲜组织经液氮速冻后于−80 °C保存至总RNA提取，同时取相同材料的部分样品干燥用于风轮菜苷A定量。收获的种子干燥后保存用于后续实验。风轮菜苷A标准品（Buddlejasaponin IVb；CAS 152580–79–5）购自上海源叶生物科技有限公司（中国上海）。
【数据】种植地点：安徽霍山（31.03°N，115.52°E）；采集时间：6月、7月、9月；生物学重复：3个；保存温度：−80 °C；标准品CAS号：152580–79–5
2.2 风轮菜中风轮菜苷A的提取与测定
取2.0 g样品，加入40 mL甲醇超声提取30 min。提取液于4 °C放置12 h，再超声处理30 min。过滤后，滤液浓缩至近干，然后经DM301大孔树脂富集纯化。使用配备Phenomenex C18柱（5 μm，110 Å，250 × 4.6 mm）的高效液相色谱（HPLC）系统（Waters）对风轮菜苷A进行定量。流动相为甲醇/水（80:20，v/v），流速0.8 mL·min⁻¹。柱温维持在30 °C，检测波长为250 nm。校准曲线制备：将5.0 mg风轮菜苷A标准品用流动相溶解于5 mL容量瓶中，然后梯度稀释至0.50、0.25、0.125、0.050和0.025 mg·mL⁻¹。每个标准溶液进样20 μL，记录峰面积，以峰面积（Y）对浓度（X，mg·mL⁻¹）作图构建校准曲线。
【数据】样品量：2.0 g；提取溶剂：40 mL甲醇；超声时间：30 min；静置条件：4 °C、12 h；二次超声：30 min；色谱柱：Phenomenex C18（5 μm，110 Å，250 × 4.6 mm）；流动相：甲醇/水（80:20，v/v）；流速：0.8 mL·min⁻¹；柱温：30 °C；检测波长：250 nm；标准品浓度梯度：0.50、0.25、0.125、0.050、0.025 mg·mL⁻¹；进样量：20 μL
2.3 转录组测序与共表达分析筛选候选基因
使用FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit分别从风轮菜各组织的每个生物学重复中提取总RNA。RNA浓度、纯度和完整性通过NanoDrop 2000和琼脂糖凝胶电泳评估。将三个生物学重复的等量RNA混合后进行文库构建和测序。十个混合文库在DNBSEQ-T7平台上测序。原始reads用SOAPnuke（v2.1.9）进行质量过滤以获得clean data，随后使用HISAT2（v2.2.1）比对到风轮菜参考基因组（未发表）。使用StringTie（v3.0.3）对每个样本进行转录本重构。将所有样本的组装结果合并，生成最终统一的转录本和基因集。基因表达水平使用StringTie（v3.0.3）基于reads比对进行定量，并以每百万转录本（TPM）归一化。参照先前在茶树和洋甘菊中描述的分析方法，使用WGCNA构建基因共表达网络。归一化的基因表达矩阵首先经过过滤，去除在十个样本中方差为零的基因和缺失值超过10%的基因。使用pickSoftThreshold函数测试1至10和12至20的软阈值功率，以近似无标度网络拓扑。基于无标度拓扑标准，选择软阈值功率20用于后续网络构建。使用blockwiseModules函数构建无符号共表达网络，参数如下：TOMType = "unsigned"，minModuleSize = 20，reassignThreshold = 0，mergeCutHeight = 0.4，pamRespectsDendro = FALSE。计算每个模块的模块特征基因，并使用Pearson相关分析将其与十个组织中的风轮菜苷A含量进行关联。Pearson相关系数 > 0.8且P < 0.001的模块被认为与风轮菜苷A积累显著相关。
【数据】测序平台：DNBSEQ-T7；软件版本：SOAPnuke v2.1.9、HISAT2 v2.2.1、StringTie v3.0.3；软阈值功率：20；minModuleSize：20；mergeCutHeight：0.4；相关系数阈值：r > 0.8，P < 0.001；缺失值过滤阈值：>10%
2.4 OSC鉴定与系统发育分析
为优先筛选参与风轮菜苷A生物合成的候选OSC基因，对风轮菜苷A共表达模块中鉴定到的OSC基因进行进一步分析。基于已表征的拟南芥和人参OSC基因鉴定风轮菜中的推定OSC基因。序列同一性 > 35%且查询覆盖率 > 50%的序列被视为候选OSC。采用相同方法，在唇形科另外四个物种——细风轮菜、南丹参、黄芩和半枝莲——中也鉴定了OSC基因。为阐明OSC基因的进化关系，使用MUSCLE（v5.3）以默认参数对来自人参、拟南芥及本研究中鉴定到的OSC蛋白序列进行多序列比对。使用trimAl（v1.5.0）以默认设置进行序列修剪。随后使用IQ-TREE（v2.3.6）中的MixtureFinder选择最优替代模型，并以1000次bootstrap迭代推断最大似然系统发育树。最终使用Interactive Tree of Life（iTOL）在线资源（版本6）进行树的可视化和优化。
【数据】序列同一性阈值：>35%；查询覆盖率阈值：>50%；软件版本：MUSCLE v5.3、trimAl v1.5.0、IQ-TREE v2.3.6；bootstrap迭代：1000次；iTOL版本：6
2.5 风轮菜中CcbAS基因的克隆与分析
使用逆转录试剂盒（iScience）按照制造商说明将风轮菜总RNA逆转录为cDNA。基于CcbAS基因序列设计CcbAS基因特异性引物（表S1），使用Hieff Canace Plus高保真DNA聚合酶通过PCR扩增编码区。PCR产物使用Mei5bio HiPer pTOPO-Blunt克隆试剂盒（MF021）连接，转化到DH5α中，筛选阳性克隆后由通用生物（安徽，中国）进行测序。使用ProtParam计算CcbAS蛋白的理化性质（氨基酸长度、理论等电点和相对分子质量）。使用DNAMAN 9.0对CcbAS与来自人参、紫苏和丹参的bAS进行多序列比对，以鉴定保守结构域。
【数据】逆转录试剂盒：iScience；高保真聚合酶：Hieff Canace Plus；克隆试剂盒：Mei5bio HiPer pTOPO-Blunt（MF021）；感受态细胞：DH5α；比对软件：DNAMAN 9.0；理化性质分析工具：ProtParam
2.6 实时荧光定量PCR（qPCR）分析
使用ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（Vazyme，Q411-02）在CFX06 Real-Time System（Bio-Rad）上进行qPCR。每个20 μL反应体系包含10 μL 2 × Master Mix、各0.5 μmol·L⁻¹引物、2 μL稀释cDNA和无核酸酶水。循环程序为：95 °C 30 s，随后40个循环的95 °C 10 s和60 °C 30 s。进行熔解曲线分析以验证扩增特异性。引物序列列于补充表S1。每个样本进行三个技术重复。相对表达量使用2−ΔΔCt方法计算，以GAPDH为内参基因。数据以三个独立生物学重复的平均值 ± SD表示。使用GraphPad Prism 9.3进行统计分析。
【数据】反应体系：20 μL；Master Mix：10 μL；引物浓度：0.5 μmol·L⁻¹；cDNA用量：2 μL；预变性：95 °C、30 s；循环条件：95 °C、10 s，60 °C、30 s，40个循环；内参基因：GAPDH；技术重复：3个；生物学重复：3个；分析方法：2−ΔΔCt；统计软件：GraphPad Prism 9.3
2.7 CcbAS的亚细胞定位
使用在线网站（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi）预测CcbAS的亚细胞定位。将CcbAS的编码序列与pCAMBIA1305-GFP载体中的GFP融合，生成重组质粒。含有拟南芥PIP2A质膜信号蛋白片段与红色荧光蛋白mCherry ORF融合的pBI221-PM-mCherry载体用作膜定位对照标记。将重组载体和对照载体分别转化到农杆菌中，注射烟草叶片表皮细胞，培养后在激光共聚焦显微镜下观察GFP和mCherry荧光信号。
【数据】载体：pCAMBIA1305-GFP、pBI221-PM-mCherry；膜标记蛋白：拟南芥PIP2A；荧光蛋白：GFP、mCherry；观察对象：烟草叶片表皮细胞
研究结果
3.1 风轮菜中风轮菜苷A的测定
采用HPLC测定了十个风轮菜样品中的风轮菜苷A含量（Cc−6-R、Cc−6-S和Cc−6-L；Cc−7-R、Cc−7-S和Cc−7-L；Cc−9-R、Cc−9-S、Cc−9-L和Cc−9-F）。以浓度X（mg·mL⁻¹）为横坐标、峰面积Y为纵坐标进行校准，得到线性回归方程Y = 2.0 × 10⁷X + 44,747，r² = 0.9999。结果表明，根、茎和花中的风轮菜苷A含量无显著差异（p > 0.05），而叶片中含量最高。9月采集的叶片中含量最高（0.1484 mg/g），其次为7月采集的叶片（0.0866 mg·g⁻¹）和6月采集的叶片（0.0692 mg·g⁻¹）。含量最低的为9月采集的花。这些结果表明，叶片是风轮菜苷A的主要积累部位，其含量呈现发育动态变化，在9月达到峰值（图2）。
【数据】线性回归方程：Y = 2.0 × 10⁷X + 44,747；r² = 0.9999；9月叶片含量：0.1484 mg/g；7月叶片含量：0.0866 mg·g⁻¹；6月叶片含量：0.0692 mg·g⁻¹；根茎花差异：p > 0.05
3.2 风轮菜的RNA-seq与共表达分析
对风轮菜十个发育阶段和组织进行了RNA-seq，产生79.22 Gb clean data（表S2）。转录本组装获得33,998个基因和36,866个转录本，平均转录本长度为1830 nt（表S3）。功能注释将32,231个基因（97.74%）分配至已知数据库，主要GO条目包括细胞过程、细胞解剖实体和催化活性（图S1）。表达谱显示，根、茎、叶和花中分别至少有33,322个（98.01%）、33,421个（98.30%）、33,235个（97.75%）和33,134个（97.46%）基因表达（表S4）。为鉴定与风轮菜苷A积累相关的基因，从表达数据构建了基因共表达模块，并将模块特征基因与代谢物水平进行关联。共定义了18个模块，其中MEgreen与风轮菜苷A含量呈强正相关（Pearson r = 0.89，p < 0.001，图3a）。MEgreen包含1868个基因，显著富集于硫代葡萄糖苷生物合成（ko00966）、倍半萜和三萜生物合成（ko00909）以及萜类骨架生物合成（ko00900）通路（Q < 0.05；图3b）。该模块包含两个OSC，Cch_G1487和Cch_G22447.1，其中Cch_G1487在各组织中的转录丰度远高于另一个。两个OSC的表达模式均与风轮菜苷A积累高度正相关（p < 0.01）（图3c，d）。
【数据】clean data总量：79.22 Gb；基因数：33,998；转录本数：36,866；平均转录本长度：1830 nt；功能注释率：97.74%（32,231个基因）；根部表达基因：33,322（98.01%）；茎部：33,421（98.30%）；叶片：33,235（97.75%）；花：33,134（97.46%）；模块数：18；MEgreen与风轮菜苷A相关系数：r = 0.89，p < 0.001；MEgreen基因数：1868；富集通路Q值：<0.05；OSC与风轮菜苷A相关性：p < 0.01
3.3 CcbAS基因的鉴定、克隆与分析
为系统鉴定风轮菜中的OSC基因并研究其与其他唇形科物种OSC的进化关系，对风轮菜及另外四种唇形科植物的OSC基因家族进行了全面表征。结果显示，风轮菜含有16个OSC基因，多于细风轮菜（9个基因）、南丹参（8个基因）、黄芩（8个基因）和半枝莲（6个基因）（表S5）。此外，风轮菜中所有16个OSC蛋白均含有完整的N端结构域（PF13249）和C端结构域（PF13243），进一步证实了这些OSC基因的完整性（表S6）。结合来自人参和拟南芥的功能表征OSC进行的系统发育分析显示，来自风轮菜的5个OSC、细风轮菜的2个、南丹参的2个和半枝莲的1个聚集在bAS分支相关的进化支中（图4a）。这一进化模式进一步表明bAS在唇形科中广泛存在，提示其在进化过程中具有高度的功能保守性。其中，Cch_G1487通过WGCNA显示与风轮菜苷A积累呈强正相关，因此被选用于进一步的功能表征。克隆的Cch_G1487 CDS全长2289 bp，编码763个氨基酸的蛋白，命名为CcbAS（图4b）。我们发现CcbAS与bASs具有高度相似性：与两个人参bAS（AB009030.1、AB014057.1）具有87.96%的序列相似性，与紫苏bAS（KAH6756583.1）和丹参bAS（XP_042046349.1）分别具有91.34%和89.8%的相似性。此外，CcbAS氨基酸序列保守区域的比对分析（图4c）显示，CcbAS具有OSC酶的典型保守区域。CcbAS不仅含有DCTAE基序（被认为是底物结合基序，在真核OSC中高度保守），还具有MWCYCR基序（bAS的特征性基序）。此外，它拥有4个QW基序，可能起到加强酶结构稳定性和稳定碳正离子中间体的作用。因此，这些结果表明CcbAS在序列和系统发育水平上均是一个高度保守的bAS。
【数据】风轮菜OSC基因数：16；细风轮菜：9；南丹参：8；黄芩：8；半枝莲：6；结构域：PF13249、PF13243；CcbAS CDS长度：2289 bp；编码氨基酸：763 aa；与人参bAS相似性：87.96%；与紫苏bAS相似性：91.34%；与丹参bAS相似性：89.8%；保守基序：DCTAE、MWCYCR、4个QW基序
3.4 CcbAS的组织特异性表达
基于克隆的CcbAS序列设计引物，以GAPDH为内参基因（表S1）。标准曲线分析显示，GAPDH的扩增效率为99.2%，CcbAS为105.5%，线性良好（R²分别为0.992和0.993）。对风轮菜不同发育阶段和组织的qPCR分析揭示了明显的组织特异性表达模式：CcbAS基因表达水平在Cc-L−9中最高，在Cc-F−9中最低。为评估CcbAS表达与风轮菜苷A积累之间的关系，使用十个样品进行了相关性分析。风轮菜苷A含量与qPCR测定的CcbAS表达呈显著正相关（r = 0.656，p < 0.05），与基于RNA-seq数据的CcbAS转录本丰度（FPKM）也呈显著正相关（r = 0.798，p < 0.01），表明CcbAS表达与风轮菜苷A含量之间存在正相关关系（图4d）。
【数据】GAPDH扩增效率：99.2%；CcbAS扩增效率：105.5%；R²：0.992（GAPDH）、0.993（CcbAS）；最高表达组织：Cc-L−9；最低表达组织：Cc-F−9；qPCR相关系数：r = 0.656，p < 0.05；RNA-seq相关系数：r = 0.798，p < 0.01
3.5 CcbAS的亚细胞定位
在烟草叶片表皮细胞中进行了亚细胞定位分析。结果显示，在表达pCAMBIA1305-CcbAS-GFP的叶片中，GFP荧光主要分布在细胞质中，并与质膜标记mCherry显示明显的重叠。相比之下，在表达pCAMBIA1305-GFP的对照叶片中，GFP荧光广泛分布于整个细胞，包括质膜、细胞质和细胞核。这些观察结果表明，CcbAS主要定位于细胞质并与质膜相关联（图5）。
【数据】定位结果：细胞质和质膜；对照载体：pCAMBIA1305-GFP；膜标记：mCherry；观察细胞：烟草叶片表皮细胞
3.6 农杆菌介导的风轮菜中CcbAS瞬时过表达
为研究CcbAS的功能，在风轮菜中建立了农杆菌介导的瞬时表达系统。将重组构建体pCAMBIA1305-CcbAS导入根癌农杆菌GV3101并浸润风轮菜叶片，以空载体pCAMBIA1305作为对照。通过优化菌悬液密度、浸润条件和光/暗孵育，建立了最佳瞬时表达系统：用OD600 = 0.8的农杆菌悬浮液注射浸润叶片，随后暗培养48 h，再光照培养72 h。浸润后第5天取样。通过qPCR测定CcbAS基因表达水平，通过HPLC定量风轮菜苷A含量。如图6所示，pCAMBIA1305-CcbAS植株中CcbAS基因表达水平比对照高1.82倍，风轮菜苷A含量比对照高2.18倍，表明CcbAS是参与风轮菜苷A生物合成的关键上游酶。在瞬时表达条件下，未检测到替代三萜骨架或其他皂苷的明显积累，表明CcbAS作为主要的β-香树脂醇合酶发挥作用。
【数据】农杆菌菌株：GV3101；菌悬液OD600：0.8；暗培养：48 h；光照培养：72 h；取样时间：浸润后5天；CcbAS表达倍数：1.82倍；风轮菜苷A含量倍数：2.18倍
3.7 VIGS沉默验证CcbAS功能
为进一步验证CcbAS在风轮菜苷A生物合成中的功能，采用病毒诱导基因沉默（VIGS）技术在风轮菜叶片中沉默CcbAS。qPCR分析显示，与对照相比，CcbAS沉默植株中CcbAS表达显著降低（图7a）。相应地，CcbAS沉默植株中风轮菜苷A含量比对照降低了53.06%（图7b）。HPLC离子色谱图进一步证实了风轮菜苷A含量的降低（图7c）。这些结果从反向遗传学角度进一步证实了CcbAS在风轮菜苷A生物合成中的关键作用。
【数据】沉默效率：CcbAS表达显著降低；风轮菜苷A含量降低：53.06%；检测方法：qPCR、HPLC
讨论与解读
风轮菜长期用于治疗出血性疾病，其止血和抗炎特性主要归因于风轮菜苷A。尽管其药理价值已获认可，但风轮菜苷A的生物合成途径在很大程度上仍未明确。WGCNA已成为鉴定非模式药用植物候选生物合成基因的有力工具。传统方法依赖差异表达分析，往往产生数百个差异表达基因，难以优先筛选候选基因进行功能表征。本研究将WGCNA应用于风轮菜十个组织和发育阶段的转录组数据。与传统的成对比较不同，WGCNA鉴定出单个模块（MEgreen，r = 0.89，p < 0.001），仅包含1868个基因，显著富集于风轮菜苷A生物合成相关通路，从中快速锁定CcbAS为顶级候选基因。虽然下游酶的功能验证仍在进行中，但当前数据为理解上游生物合成步骤提供了基础，并指导未来研究阐明完整途径。这种整合方法通过整合代谢物数据高效过滤候选基因，将筛选库从数千个减少到可控数量。
本研究通过WGCNA策略从非模式药用植物风轮菜中成功鉴定并功能验证了bAS基因CcbAS。方法上的亮点在于：针对风轮菜缺乏稳定遗传转化体系的瓶颈，建立了瞬时过表达和VIGS两种互补的农杆菌介导快速验证平台，将功能验证周期大幅缩短。瞬时过表达使风轮菜苷A含量提升2.18倍，VIGS沉默使其降低53.06%，正反向验证相互印证，证据链完整。局限在于：仅验证了上游首个关键酶，下游修饰酶（如糖基转移酶、细胞色素P450）尚未鉴定；瞬时表达系统虽快速但无法实现稳定遗传改良。未来若能将CcbAS与下游候选基因共表达于微生物底盘或稳定转化风轮菜，有望实现风轮菜苷A的异源合成或含量提升。
参考来源
期刊：Plant Science, 2026
DOI: 10.1016/j.plantsci.2026.113314
DOI: 10.1016/j.plantsci.2026.113314