来源：Impedimetric detection of Escherichia coli with bacteriophage immobilized polyaniline-chitosan modified thread based biosensor for healthcare and water quality monitoring（Biosensors and Bioelectronics: X）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
大肠杆菌是生物研究、抗生素耐药性研究和环境监测中的模式微生物，其致病菌株引发的食源性和水源性感染对公共卫生构成重大威胁。本研究开发了一种一次性纤维素线基阻抗传感器，以T4噬菌体作为生物识别元件，通过聚苯胺-壳聚糖功能化修饰棉线基底，实现了对大肠杆菌B40的特异性检测。传感器在PBS和饮用水中的检测限为10³ CFU/mL，在模拟脑脊液样本中为10⁴ CFU/mL，并验证了对非宿主菌株和干扰物的特异性。
研究背景
大肠杆菌感染的临床治疗正变得日益困难，抗生素耐药性的流行使这一问题更加严峻。据《柳叶刀》报道，2019年耐药性大肠杆菌菌株导致了超过80万例死亡，而全球因抗微生物耐药性（AMR）导致的死亡总数估计达500万。这一日益加重的疾病负担迫切需要开发低成本、快速、可靠的细菌早期检测工具，尤其是在实验室基础设施有限的中低收入国家。
传统培养方法需要24-48小时才能出结果，且往往无法检测活的但不可培养状态（VBNC）的细菌。分子方法虽然灵敏度高，但成本高昂、耗时长，需要专业技术人员和精密仪器，在基层卫生中心的可及性受限。生物传感器是快速实时检测细菌病原体的分析工具。在各类传感器中，一次性阻抗传感器为即时病原体检测提供了便携、经济的替代方案。纤维素基纸和线传感器具有独特的优势，如生物相容性、可生物降解性等。
研究方法
2.1 试剂
中分子量壳聚糖（CS，50,000–190,000 Da）购自Merck，苯胺（分子质量93.13 g/mol）购自Himedia，过硫酸铵（APS）、氯仿、硫酸（H₂SO₄）和盐酸（37%）购自SRL Pvt Ltd。Ag/AgCl浆料购自Sigma Aldrich。LB肉汤、LB琼脂和琼脂粉购自Himedia。用于交叉敏感性研究的D-(+)-葡萄糖-右旋糖、白蛋白和免疫球蛋白（IgG）购自Sigma-Aldrich。所有培养基均在无菌蒸馏水中配制，使用前经高压灭菌。磷酸盐缓冲液（PBS）和SM缓冲液按标准方案配制。所有培养基和缓冲液使用前均经高压灭菌并储存在冰箱中。
【数据】壳聚糖分子量：50,000–190,000 Da；苯胺分子质量：93.13 g/mol；盐酸浓度：37%；储存温度：−20°C（甘油菌种）、4°C（噬菌体）
2.2 噬菌体计数和细菌培养制备
细菌样品大肠杆菌B40（ATCC11303）和大肠杆菌DH5 Alpha（ATCC 53868）以甘油菌种形式保存在−20°C冰箱中，在生长培养基中重悬后用于本实验。噬菌体T4（11303-B4）使用其宿主大肠杆菌B40进行扩增，纯化后储存在4°C。T4噬菌体的计数采用标准噬菌斑试验进行，以PFU/mL表示。从实验室附近水净化系统收集的饮用水经高压灭菌、注射器过滤和平板涂布，以确保在不同浓度大肠杆菌重悬前无固有细菌存在。模拟脑脊液（CSF）按照Sadani等人（2020）描述的方案制备。
【数据】菌株：大肠杆菌B40（ATCC11303）、大肠杆菌DH5 Alpha（ATCC 53868）；噬菌体：T4（11303-B4）；储存温度：−20°C（细菌）、4°C（噬菌体）；计数单位：PFU/mL
2.3 传感器基底的制备
将纤维素棉线切割成1 cm的片段。将这些片段在去离子水中煮沸并干燥以去除松散沉淀物。风干后，将线在APS（强氧化剂）存在下进行苯胺（0.1 M）的氧化聚合反应，得到PAni涂覆的线。这些线进一步风干，随后通过浸涂法涂覆0.1% CS溶液。共进行12次浸涂循环以确保所有基底上薄膜厚度均匀。干燥后，将制备在0.1 M KCl中的Ag/AgCl导电墨水施加到电极一端，用作伪参比电极并提供修饰线与连接夹之间的电接触。干燥后，将PAni-CS涂覆的线与T4噬菌体（10⁹ PFU/mL）孵育。使用扫描电子显微镜（SEM）（JEOL JSM-7600）表征传感器表面并观察孵育后的细菌相互作用。
【数据】线长度：1 cm；苯胺浓度：0.1 M；CS浓度：0.1%；浸涂循环：12次；Ag/AgCl墨水溶剂：0.1 M KCl；噬菌体浓度：10⁹ PFU/mL；仪器：JEOL JSM-7600 SEM
2.4 大肠杆菌B40的阻抗检测
将功能化线通过环形导线连接到恒电位仪，如图1a所示。所有电化学测量均使用FRA32M频率响应分析模块，与Autolab PGSTAT（Metrohm）联用。首先，将线在SM缓冲液中进行T4噬菌体（10⁹ PFU/mL）的固定化，持续1小时。施加+0.5 V的正电位（vs. Ag/AgCl伪参比电极）以促进噬菌体的定向固定化。施加的电位使电极表面带正电，在表面附近产生电场，吸引带负电的噬菌体。这使噬菌体以其带负电的头部朝向电极方向排列。使用高噬菌体浓度（10⁹ PFU/mL）以确保更大的MOI和与细菌裂解对应的可测量信号响应。然后用SM缓冲液冲洗线以去除任何未结合的噬菌体，并在真空下干燥。由于pH和离子强度的变化会影响测量，实验在标准化PBS（pH 7.2，10 mM PBS）中进行，这为噬菌体活性和阻抗测量提供了稳定的环境。在PBS中稳定45分钟后，将噬菌体功能化的线与不同浓度的大肠杆菌悬浮液（10²、10³、10⁴、10⁵和10⁶ CFU/mL，制备于PBS中）孵育，随后进行阻抗测量。使用EIS评估大肠杆菌B40与T4固定化线之间的相互作用，以PBS作为对照。阻抗数据以15分钟为间隔收集，频率范围为10 kHz至5 Hz。噬菌体取向和细菌固定化的示意图见图1b。对于实际样品测试，所有测试基质均含有实验室配制的标准缓冲参考溶液。该标准溶液包含样品基质中可能存在的所有典型成分。一旦达到稳定，将传感器与目标分析物孵育，分析物与实验室参考溶液以1:1比例缓冲，记录所得的阻抗变化。这有助于减轻基质效应。展示配制的缓冲模拟基质的表格见SI-2。
【数据】噬菌体浓度：10⁹ PFU/mL；施加电位：+0.5 V；固定化时间：1 h；PBS浓度：10 mM，pH 7.2；稳定时间：45 min；大肠杆菌浓度：10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶ CFU/mL；阻抗采集间隔：15 min；频率范围：10 kHz至5 Hz；分析物与参考溶液比例：1:1
研究结果
3.1 线基底的表征
使用Bruker Alpha II光谱仪在衰减全反射（ATR）模式下对PAni-CS功能化线进行傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析（图1c）。PAni-CS涂覆线的FTIR光谱显示在3254 cm⁻¹处有一个宽峰，对应于PAni和CS的N–H伸缩振动。2854 cm⁻¹处的峰归因于对称C–H伸缩振动。1579 cm⁻¹处的峰可归因于醌型的伸缩振动。1499 cm⁻¹处观察到的峰归因于苯环的伸缩振动。1418 cm⁻¹处的峰可归属于CS吡喃环中CH₂的伸缩振动。1310 cm⁻¹处的峰对应于仲芳香胺的C–N伸缩。1155 cm⁻¹处的峰可归因于CS的C–O–C桥的不对称伸缩。1107 cm⁻¹和806 cm⁻¹处的峰分别可归属于苯环的C–N伸缩模式和芳香C-H面外弯曲振动。使用聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）检查PAni-CS修饰线的表面形貌。表面呈现粗糙多孔。CS形成多孔纤维网络，而PAni以颗粒形式分布在CS网络表面。形貌还表明PAni与CS之间存在界面接触。图1(d–i)显示了PAni-CS涂覆线的SEM横截面图像，揭示了高度纤维化和多孔的结构，为后续修饰提供了大的表面积。图1(d-ii)展示了修饰线的表面形貌。图1(d-iii)展示了PAni-CS复合层，其中PAni形成短纤维网络，而CS填充间隙空间。这增强了表面粗糙度并促进噬菌体固定化，从而促进大肠杆菌细胞的结合。图1(d-iv)显示了大肠杆菌的放大图像，其呈现为变形杆状，可能表明细菌裂解过程。PAni和PAni-CS的表面积也通过Brunauer Emmett Teller（BET）表征使用Smart Sorb 92/93表面积分析仪进行分析。结果见SI-3表3。PAni-CS复合材料表面积的减小是由于CS阻塞了PAni纳米纤维的孔隙。
【数据】FTIR峰位：3254、2854、1579、1499、1418、1310、1155、1107、806 cm⁻¹；仪器：Bruker Alpha II（ATR模式）、FIB-SEM、Smart Sorb 92/93 BET分析仪
3.2 电化学表征及PBS中大肠杆菌检测
EIS用于进一步表征传感器基底并监测其逐步修饰过程。图2显示了每个制备步骤（包括裸线、PAni-CS线、CS沉积的PAni线、随后的T4噬菌体固定化和大肠杆菌结合）的EIS测量所得Nyquist图。用于拟合EIS数据的等效电路显示在插图中，各修饰步骤的相应拟合参数总结在表1中。用导电聚合物PAni修饰裸线后，观察到电荷转移电阻（Rct）降低。随后浸涂CS导致Rct进一步降低，表明PAni和CS之间的协同效应改善了结构完整性和导电性。将噬菌体T4孵育到修饰线上后，Rct增加，表明有效的噬菌体结合。与细菌溶液孵育10分钟后观察到Rct进一步增加，证实了固定化噬菌体对细菌细胞的捕获。相应的拟合参数包括Rsol（Ω）、Rct（Ω）和Q1（Ω⁻¹·sⁿ）总结在表4（SI-3.A）中。此外，逐步修饰的有效双电层电容（Cdl）、比电容（Cs）和电活性表面积（ECSA）已计算，详情见SI-3-A。噬菌体（10⁹ PFU/mL）在PAni-CS杂化线上的固定化通过EIS确认（SI-3.B）。线在含T4噬菌体的500 μL SM缓冲液中孵育。线基底的长度优化为1 cm，基于T4噬菌体固定化所需的有效表面积，同时防止线折叠。长度优化的详细研究见SI-3.C。虽然仅50 μL就足以完全润湿1 cm长度的线，但更高体积确保孵育期间线完全浸没。基于样品浓度，预计约10⁷ PFU接触线表面。为验证噬菌体固定化，通过噬菌斑试验定量，定期测量从线解吸的噬菌体浓度。解吸噬菌体的浓度随时间降低，表明强结合的噬菌体保持固定在线上的。结果见SI-3.D。图3a显示了噬菌体在PAni-CS基底上结合动力学的Nyquist图。构建了电等效电路以拟合EIS数据，如图3a插图所示。Rct随时间的变化表明噬菌体在线的表面逐步固定化，约50分钟后开始稳定（图3b）。T4噬菌体带负电的衣壳与带正电的PAni-CS线发生静电相互作用，促进固定化。施加+0.5 V正电位促进了噬菌体的定点取向，促进有效的细菌结合。将噬菌体功能化的线在大肠杆菌（10³-10⁶ CFU/mL）悬浮液（PBS中）中孵育1小时后，大肠杆菌B40与T4噬菌体的初始结合增加了阻抗。随后由于细菌裂解，阻抗在大约30分钟内下降，如图3c所示。图3d描绘了Nyquist图。噬菌体功能化线在细菌悬浮液中的Rct（t = 30 min）低于仅PBS中的，可能是由于培养基中发生的细菌裂解。通过改变细菌浓度（10³-10⁶ CFU/mL）同时保持线上噬菌体浓度恒定，进行了浓度依赖性研究。构建了等效电路模型，并监测溶液电阻（Rsol）的变化。分析显示Rsol随细菌浓度增加而降低。当噬菌体与线上的细菌结合时，电极-电解质界面的溶液电阻发生变化，影响局部离子浓度和迁移率，从而增加系统的有效电导率。因此，更高的细菌浓度导致更低的溶液电阻，如图3e所示。在测定过程中研究了细菌计数、pH、吸光度变化和噬菌体效价等参数，以评估本体溶液中产生的物理化学变化（SI-3-E和F）。
【数据】噬菌体浓度：10⁹ PFU/mL；SM缓冲液体积：500 μL；线长度：1 cm；预计接触噬菌体量：约10⁷ PFU；噬菌体固定化稳定时间：约50 min；施加电位：+0.5 V；大肠杆菌浓度：10³-10⁶ CFU/mL；孵育时间：1 h；细菌裂解时间：约30 min
3.3 实际样品测试
为评估T4固定化线生物传感器在实际样品中的性能，将不同浓度的大肠杆菌B40（10³-10⁷ CFU/mL，经平板计数确认）重悬于饮用水和人工CSF样品中。在两种样品类型中，归一化溶液电阻随大肠杆菌浓度增加而降低，证明了该生物传感器对大肠杆菌B40选择性检测的有效性和可行性。观察到的选择性源于T4噬菌体的特异性结合和裂解活性，其不与非宿主细菌菌株相互作用。该传感器在饮用水中的检测限为10³ CFU/mL，在模拟CSF样品中为10⁴ CFU/mL，检测对数范围分别为10³-10⁶ CFU/mL和10⁴-10⁷ CFU/mL。
【数据】大肠杆菌浓度范围：10³-10⁷ CFU/mL；饮用水中检测限：10³ CFU/mL；模拟CSF中检测限：10⁴ CFU/mL；饮用水检测范围：10³-10⁶ CFU/mL；模拟CSF检测范围：10⁴-10⁷ CFU/mL
讨论与解读
本研究开发了一种一次性、经济高效的线基传感器，使用噬菌体T4作为生物识别元件，用于快速、特异性地检测大肠杆菌B40。该传感器设计简单、易于批量制造、具有生物相容性，适合即时/护理点应用。当代文献中大多数传感器需要使用抗体或适配体等生物识别元件，这些元件昂贵且需要严格的操作条件。然而，噬菌体在实验室环境中易于纯化和维持。纤维素线通过APS原位氧化聚合苯胺形成PAni进行修饰。APS通过氧化苯胺形成苯胺阳离子自由基启动聚合，这些自由基偶联形成聚合物链。纤维素纤维的羟基（-OH）与PAni的胺基（-NH）之间的强分子间氢键稳定了PAni-纤维素相互作用。PAni涂覆的线随后涂覆CS，通过氢键相互作用。PAni-CS修饰的线由于末端-NH₂基团的存在而具有整体净正电荷。这促进了T4噬菌体带负电头部的结合。当暴露于携带净负电荷的大肠杆菌B40时，T4噬菌体尾丝与细菌全细胞之间发生结合，随后细菌裂解和细菌裂解物在基底上积累。
编译者解读
该研究在合成生物学与生物传感的交叉领域提供了一个务实的方案：用噬菌体替代抗体作为识别元件，大幅降低了成本并简化了操作条件。线基基底的选择兼顾了柔性与可规模化生产，PAni-CS涂层通过静电作用实现噬菌体定向固定，思路清晰。然而，传感器在模拟CSF中检测限升至10⁴ CFU/mL，提示复杂基质对性能有实质影响；噬菌体在基底上的长期稳定性数据也尚不充分。未来若能将噬菌体工程化改造以拓展宿主谱，或整合微流控实现多靶标并行检测，将进一步提升其在临床和环境监测中的实用价值。
参考来源
期刊：Biosensors and Bioelectronics: X, 2026
DOI: 10.1016/j.biosx.2026.100778
DOI: 10.1016/j.biosx.2026.100778