来源：Rapid electrochemical detection of Escherichia coli in milk using an oriented phage-based biosensor（Talanta）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
食源性致病大肠杆菌污染是乳制品安全的核心隐患，传统培养法和PCR虽准确但耗时数小时至数天，难以满足现场快速筛查需求。本研究将T4噬菌体共价固定于ITO电极表面，并在固定过程中施加10 V、16.67 kHz梯形波电场，利用噬菌体尾丝带正电、头部带负电的偶极特性实现定向排列，使尾丝受体结合蛋白朝向溶液以高效捕获细菌。该传感器在PBS中检测限为62 CFU/mL，在未稀释脱脂牛奶中检测限低至12 CFU/mL，15分钟完成检测，4°C储存两周仍保持响应。
研究背景
食源性污染持续威胁全球公共卫生。据世界卫生组织估计，全球每年近十分之一的人口因食用受污染食品而患病，导致42万人死亡；中低收入国家因不安全食品造成的生产力损失和医疗支出每年至少达1100亿美元。在众多细菌污染物中，大肠杆菌是乳制品、肉类和新鲜农产品相关疫情中最常见的食源性致病菌之一，因此快速可靠地检测食品中的大肠杆菌对防止大规模污染事件至关重要。
传统微生物学和分子方法（培养法、PCR、ELISA）准确性高，但实际操作存在明显短板：劳动强度大、需要专业人员、出结果可能需数小时甚至数天。这些局限阻碍了及时决策，使其不适合食品行业的实时或现场监测。因此，亟需快速、灵敏、低成本且能直接检测的分析策略。
研究方法
2 材料与方法。本研究中材料、化学品、细菌与噬菌体制备、噬菌体沉积池、X射线光电子能谱（XPS）电极表征、扫描电子显微镜（SEM）电极表征、生物传感器特异性、生物传感器稳定性、分析物循环使用等详细信息见补充材料。
2.1 ITO电极修饰。将ITO玻璃基底切割为12 × 25 mm片，依次在丙酮、乙醇、异丙醇和去离子水中超声清洗，每步3分钟，最后一步去离子水清洗重复两次。随后将基底用RCA溶液（H₂O:NH₄OH 25%:H₂O₂ 30% = 5:2:2，v/v/v）在80 °C处理10分钟，然后用去离子水冲洗三次。硅烷化处理时，将APTES（99%）与无水乙醇按1:9（v/v）混合制备10%（v/v）的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶液。将ITO基底浸入APTES溶液中，室温轻柔振荡（90 rpm）30分钟，用乙醇冲洗三次，然后在110 °C烘箱中固化1小时。随后用2.5%（v/v）戊二醛（GA）进行表面活化，GA溶液（25%）用去离子水按1:9（v/v）稀释制备。该条件可获得可重复的表面修饰，但GA浓度和孵育时间未进行系统优化。ITO样品在GA中室温孵育2小时，同时以90 rpm振荡，然后用去离子水冲洗三次。
【数据】清洗时间：每步3min；RCA温度：80°C；RCA时间：10min；APTES浓度：10%（v/v）；硅烷化时间：30min；硅烷化温度：室温；振荡速度：90rpm；固化温度：110°C；固化时间：1h；GA浓度：2.5%（v/v）；GA孵育时间：2h；GA孵育温度：室温
2.2 电场辅助噬菌体沉积。电场沉积系统的详细描述见我们此前的研究[28,29]。沉积池按已发表设计[28,29]定制加工，包含六个独立腔室，作为电容器填充噬菌体悬浮液（图S1–S15）。ITO片作为工作电极，铜板作为对电极。200 μm PTFE垫片将铜板与噬菌体悬浮液电隔离，从而消除法拉第电流并确保纯电容耦合。沉积时，将200 μL T4噬菌体悬浮液（终浓度10¹¹ PFU/mL，溶于TM缓冲液）引入腔室。函数发生器输出连接ITO电极，铜电极接地。由于T4病毒粒子衣壳带负电、尾丝带正电，因此施加正电位以促进定向固定。由函数发生器（DG1022，Rigol，中国）施加幅度10 V、频率16.67 kHz的梯形波形，并用示波器（DS1052E，Rigol，中国）监测。该信号经证实对提高传感器灵敏度最佳[28,29]。对照基底以相同方式处理但不施加电压。沉积进行30分钟，之后用过量TM缓冲液冲洗去除未结合噬菌体。电场仅在沉积期间使用以促进病毒粒子优先定向，而已形成层的稳定化由随后与GA/APTES修饰表面的共价连接提供。最后，表面用1% BSA的PBS溶液在室温、90 rpm振荡下处理30分钟以封闭非特异性结合位点。
【数据】噬菌体悬浮液体积：200μL；噬菌体终浓度：10¹¹ PFU/mL；电压：10V；频率：16.67kHz；波形：梯形波；沉积时间：30min；PTFE垫片厚度：200μm；BSA浓度：1%；封闭时间：30min；封闭温度：室温；振荡速度：90rpm
2.3 DPV表征修饰电极。差分脉冲伏安法（DPV）使用BioLogic SP-300电化学工作站，通过EC-Lab软件操作。采用常规三电极体系：修饰ITO工作电极、铂丝对电极（d = 1 mm）、Ag|AgCl参比电极（3 M NaCl，含凝胶添加剂以减轻氯离子迁移）。所有实验在22 ± 2 °C下于PTFE池中进行，电解液为0.1 M NaNO₃含1 mM K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆（1:1）。等摩尔Fe(CN)₆³⁻/Fe(CN)₆⁴⁻电对作为可逆氧化还原探针，评估修饰电极的电子转移性能。DPV扫描从−0.20 V至0.80 V，脉冲幅度50 mV，脉冲宽度5 ms，步高0.5 mV，采样时间10 ms。电流密度按j = I/A计算，其中I为测得的DPV峰电流，A为ITO表面暴露于电解液的几何面积。暴露面积由PTFE池开口限定，A = 0.82 cm²。
【数据】实验温度：22±2°C；电解液：0.1M NaNO₃；氧化还原探针：1mM K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆（1:1）；扫描范围：−0.20V至0.80V；脉冲幅度：50mV；脉冲宽度：5ms；步高：0.5mV；采样时间：10ms；暴露面积：0.82cm²
2.4 细菌电化学检测。将生物传感器在4 mL大肠杆菌BL21悬浮液（PBS制备，浓度范围10至10⁷ CFU/mL）中孵育。ITO电极在室温、120 rpm轨道振荡下浸泡15分钟。孵育后，电极用PBS冲洗三次以去除未粘附的细菌细胞。随后按2.3节所述程序进行DPV测量。
【数据】孵育体积：4mL；浓度范围：10至10⁷ CFU/mL；孵育时间：15min；孵育温度：室温；振荡速度：120rpm；冲洗次数：3次
2.5 加标样品。为评估生物传感器在实际样品中的性能，使用0%脂肪牛奶（Łaciate UHT 0.0%，波兰）作为模型基质。选择脱脂牛奶以最小化基质干扰，因为脂质可促进非特异性吸附/电极污染并增加信号变异性。牛奶样品一次性加标大肠杆菌BL21至终浓度10 CFU/mL、10³ CFU/mL和10⁵ CFU/mL，并设未加标对照。每个浓度独立制备（即测量之间无累积加标）。牛奶未经稀释直接使用。传感器在加标样品中室温、120 rpm轨道振荡下孵育15分钟，随后用PBS冲洗三次。然后使用2.3节所述相同参数进行DPV测量。
【数据】牛奶类型：0%脂肪UHT牛奶；加标浓度：10、10³、10⁵ CFU/mL；孵育时间：15min；孵育温度：室温；振荡速度：120rpm；冲洗次数：3次；稀释：未稀释
2.6 分析物循环。使用配备入口和出口的PTFE流动池实现生物传感器与细菌的流动辅助接触。入口和出口连接蠕动泵（Zalimp PP4/1FI53 M，Zalimp，华沙，波兰），以5 mL/min恒定流速将样品通过池循环。大肠杆菌BL21在PBS中制备为10⁴ CFU/mL，取1 mL等分试样引入封闭流动回路。同一样品等分试样循环指定次数（循环0、1、3和5次）。达到指定循环次数后停止流动，直接在池中按2.3节所述条件记录DPV。
【数据】流速：5mL/min；细菌浓度：10⁴ CFU/mL；样品体积：1mL；循环次数：0、1、3、5
2.7 数值模拟。使用COMSOL Multiphysics 6.1（COMSOL AB，瑞典）进行流动反应器中流体流动和细菌传输的数值模拟。构建了反应器的三维模型，利用沿通道纵轴的对称面以降低计算成本。
【数据】软件：COMSOL Multiphysics 6.1；模型：三维对称模型
2.8 统计学。两组间统计比较在样本量相似时使用Student's t检验，样本量不同时使用Welch's t检验。p < 0.05认为差异具有统计学意义。图中显著性水平标注如下：p < 0.05（∗），p < 0.01（∗∗），p < 0.001（∗∗∗），p < 0.0001（∗∗∗∗）。LOD按LOD = 3σ_blank/m计算，其中σ_blank为空白响应的标准差，m为校准曲线斜率。
【数据】显著性阈值：p<0.05；LOD公式：LOD = 3σ_blank/m
研究结果
3 结果与讨论。本工作旨在开发一种可适配不同细菌靶标的噬菌体电化学传感策略。该概念依赖于有尾噬菌体的固有物理特征——永久偶极矩和各向异性电荷分布[41,42]——使其对外部电场响应[43]。通过在电极表面施加电场定向病毒粒子，我们旨在增加可及结合位点数量，从而增强细菌捕获。示意图见图1C。
为验证该方法，我们使用T4噬菌体及其宿主大肠杆菌BL21作为模型系统，在氧化铟锡（ITO）电极上进行研究。Tequatrovirus T4噬菌体是已知的大肠杆菌BL21裂解性噬菌体，属于Straboviridae科[44]。T4病毒粒子具有二十面体头部，连接可收缩尾部，尾部末端为尾丝，产生永久偶极矩，在生理条件下头部主要带负电、尾丝带正电[43]。这种电荷分布允许电场辅助定向病毒粒子于电极上，增加尾丝受体结合蛋白向溶液的暴露，从而提高大肠杆菌BL21捕获效率[27,45]。选择大肠杆菌作为靶细菌，因为它是粪便污染的关键指示菌，也是与肉类、乳制品和饮用水相关疫情中常涉及的主要食源性致病菌[3–6]。因此，灵敏快速检测大肠杆菌直接关系到食品安全和环境监测。选择ITO作为换能器材料而非更传统的金或碳电极。金相对昂贵且通常需要硫醇自组装单层，可能稳定性有限且存在非特异性吸附。相比之下，碳电极常表现出表面异质性和较差的重现性。ITO则是一种光滑、化学稳定的透明导电氧化物，具有低电阻和高光学透过率。其表面可通过硅烷化学可靠修饰，非常适合可重复的生物传感器制造。此外，我们设想进一步发展，例如利用光电化学方法，ITO对此是合适的。
3.1 电极修饰。ITO首先按RCA方案清洗以去除有机和无机污染物，从而产生羟基封端表面[46]。该处理改善了表面润湿性和重现性，同时提供了对有效硅烷化至关重要的–OH基团，因为它们参与与硅烷分子的缩合反应。RCA处理后，电极用APTES修饰，通过乙氧基水解和随后与表面形成Si–O–Si键，形成共价结合的氨丙基硅烷层。末端–NH₂基团的引入使ITO表面准备好进一步功能化[47]。下一步，APTES修饰表面用戊二醛（GA）——一种醛类交联剂——活化。GA与APTES层上的伯胺反应形成亚胺（席夫碱）连接，产生醛基封端界面[48]。这些悬挂醛基随后通过噬菌体衣壳蛋白上的胺残基共价连接T4噬菌体，在电极上产生噬菌体层[49]。最后，将如此修饰的ITO板与BSA孵育以封闭剩余反应位点和未覆盖区域，从而最小化细菌和基质组分的非特异性吸附[50]。
逐步修饰通过DPV电化学确认（图2A）。在各功能化步骤后测量的表面中，裸ITO表现出最高的DPV峰电流密度，约为805 μA/cm²（在194 mV处），与未修饰表面上氧化还原探针的高效电子转移一致。APTES硅烷化后，峰电流密度降至749 μA/cm²，这是由于形成的有机硅烷层阻碍了导电表面的可及性。随后GA活化将峰进一步降至680 μA/cm²，反映了电极上额外有机层的进一步阻挡。非导电噬菌体层的固定导致更明显的下降至551 μA/cm²，因为氧化还原探针进入导电表面的通道被进一步阻断。最终BSA封闭产生最低电流475 μA/cm²，与额外蛋白质层的形成一致，该层绝缘表面并钝化残余自由位点，从而最小化后续测量中的非特异性吸附。在整个序列中，峰电位略微增加了20 mV。总之，DPV的逐渐降低证实了薄膜的逐步构建：ITO → APTES → GA → 噬菌体 → BSA阻断氧化还原探针对导电表面的可及性。
X射线光电子能谱（XPS）进一步确认了顺序表面化学变化（图2B–表S1）。裸ITO谱图显示主导的In和Sn信号（In 24.35 at.%，Sn 3.22 at.%）以及O（39.41 at.%），与氧化铟锡组成一致。APTES处理后，N和Si峰的出现（N 2.61 at.%，Si 3.60 at.%）确认了硅烷化成功。GA活化导致有机贡献增加（C从24.25增至30.89 at.%），并导致ITO基底信号衰减（In + Sn从27.35降至24.00 at.%），与额外覆盖层的形成一致。噬菌体固定后，磷变得可检测（P 1.02 at.%；P 2p在约133–134 eV），标志着其在表面上的存在，同时氮增加（至3.34 at.%）和In/Sn进一步衰减（In + Sn降至20.16 at.%）。总体而言，APTES后N/Si的出现、噬菌体沉积后P的出现以及基底贡献的逐步减少，证实了APTES/GA夹层和噬菌体在ITO上的逐步组装（图S16–S41）。
修饰电极的扫描电子显微镜（SEM）成像显示ITO–APTES–GA表面上固定的噬菌体分布不均匀（图2C和D）。较高放大倍数下，图像显示噬菌体的局部聚集和覆盖率较高的区域，而较低放大倍数下，在整个电极上观察到噬菌体特征，确认了表面功能化成功。基于对八个随机选择的化学修饰ITO定向噬菌体SEM显微图像的分析，受体层的平均堆积密度估计为6.79 ± 1.48噬菌体/μm²。总之，XPS和SEM结果表明传感层约为单病毒粒子厚度，而非形成多层膜。同时，SEM图像表明覆盖不均匀，存在局部聚集，而非完美均匀的密排单层。
【数据】裸ITO峰电流密度：约805 μA/cm²（194 mV）；APTES后：749 μA/cm²；GA后：680 μA/cm²；噬菌体固定后：551 μA/cm²；BSA封闭后：475 μA/cm²；峰电位增加：20 mV；XPS：In 24.35 at.%、Sn 3.22 at.%、O 39.41 at.%、N 2.61 at.%、Si 3.60 at.%、C 24.25→30.89 at.%、In+Sn 27.35→24.00→20.16 at.%、P 1.02 at.%；噬菌体堆积密度：6.79 ± 1.48噬菌体/μm²
3.2 电场辅助噬菌体沉积与定向。为实现噬菌体的定向沉积，对传感器电极施加正电场，将T4病毒粒子带负电的衣壳吸引向ITO表面。电场参数基于我们此前的工作[28,29]选择，其中10 V、16.67 kHz梯形波形被确定为增强传感器灵敏度的最佳条件。我们此前的工作表明，10 V是噬菌体定向的最有效电位，在促进排列的电泳力与较高电压下噬菌体失活和双电层中过量电荷积累等不利效应之间提供了折中。作为具有永久偶极矩的胶体不对称颗粒，T4噬菌体在电场中经历扭矩，使其偶极矩与电场方向对齐。因此，带正电的尾丝被导向远离带正电的ITO电极，朝向溶液，而带负电的头部被吸引到表面。这种构型增加了尾丝受体结合蛋白对细菌的可及性，从而增强捕获效率。为验证电场辅助定向的效果，我们在相同条件下制备了有和无电场辅助的噬菌体修饰电极，并比较了它们对大肠杆菌BL21的响应（图3A）。
在10⁴ CFU/mL大肠杆菌BL21存在下，电场定向噬菌体层的ΔDPV峰电流密度约为非定向噬菌体层的3倍，约为无噬菌体对照的10倍。这一结果证实了电场辅助定向在增强细菌捕获方面的重要性。此外，我们评估了电场辅助定向生物传感器在PBS中检测大肠杆菌BL21的分析性能。DPV测量在含1 mM K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆（1:1）的0.1 M NaNO₃中进行。随着细菌浓度从10增至10⁷ CFU/mL，DPV峰电流密度逐渐降低（图3B），表明非导电细菌细胞在电极表面的积累阻碍了氧化还原探针的电子转移。ΔDPV峰电流密度与大肠杆菌BL21浓度的对数在10至10⁷ CFU/mL范围内呈线性关系（图3C），校准方程为Δj = 47.3 × log C + 22.9（R² = 0.98），检测限为62 CFU/mL。
【数据】电场定向vs非定向信号比：约3倍；vs无噬菌体对照：约10倍；细菌浓度：10⁴ CFU/mL；线性范围：10至10⁷ CFU/mL；校准方程：Δj = 47.3 × log C + 22.9；R² = 0.98；LOD：62 CFU/mL
为评估特异性，我们测试了生物传感器对非宿主金黄色葡萄球菌的响应。在相同浓度下，对金黄色葡萄球菌的响应比大肠杆菌低近30倍，证明了高特异性。这种高特异性归因于T4噬菌体对其宿主大肠杆菌BL21的高度特异性识别。
【数据】金黄色葡萄球菌vs大肠杆菌响应比：低近30倍
3.3 牛奶中大肠杆菌检测。为评估生物传感器在实际样品中的性能，我们在未稀释的0%脂肪牛奶中检测大肠杆菌BL21。选择脱脂牛奶以最小化基质干扰。DPV测量在含1 mM K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆（1:1）的0.1 M NaNO₃中进行。图4A显示了BSA（PBS对照）、未加标牛奶以及加标大肠杆菌BL21（10、10³、10⁵ CFU/mL）牛奶的代表性DPV曲线。未加标牛奶的DPV峰电流密度低于PBS中的BSA对照，表明牛奶基质本身对电极表面有一定影响。随着牛奶中细菌浓度增加，DPV峰电流密度逐渐降低。ΔDPV峰电流密度与大肠杆菌BL21浓度的对数在10至10⁵ CFU/mL范围内呈线性关系（图4B），校准方程为Δj = 38.6 × log C + 18.2（R² = 0.97），检测限为12 CFU/mL。该LOD低于PBS中的62 CFU/mL，可能是由于牛奶基质中某些组分促进了细菌在电极表面的粘附。生物传感器在牛奶中保持了良好的重现性，RSD约为3–4%。
3.4 稳定性与循环。我们评估了生物传感器在4 °C储存两周后的响应。储存两周后，生物传感器对10⁴ CFU/mL大肠杆菌BL21的响应保持了初始值的约90%，表明良好的稳定性。此外，我们使用PTFE流动池评估了分析物循环对检测的影响。在5 mL/min流速下，随着循环次数从0增至5，ΔDPV峰电流密度逐渐增加，表明流动辅助接触增强了细菌在电极表面的捕获。数值模拟显示，流动池中的流体动力学条件促进了细菌向电极表面的传输。
【数据】储存条件：4°C；储存时间：两周；响应保持：约90%；细菌浓度：10⁴ CFU/mL；流速：5mL/min；循环次数：0、1、3、5
讨论与解读
本研究开发了一种基于噬菌体的电化学传感器，用于检测大肠杆菌BL21。电场辅助固定使噬菌体定向排列，在10⁴ CFU/mL时产生比非定向噬菌体层高3倍、比无噬菌体电极高10倍的信号。DPV测量验证了传感界面的逐步形成，与ITO上绝缘生物识别层的构建一致。该生物传感器在PBS中实现了10至10⁷ CFU/mL的定量检测，LOD为62 CFU/mL，对非宿主金黄色葡萄球菌表现出高特异性（相同浓度下响应低30倍）。重要的是，它可直接在0%脂肪牛奶中操作，无需预富集，15分钟孵育后LOD为12 CFU/mL。该平台在缓冲液和牛奶中均表现出良好的重现性（RSD约3–4%），并在4 °C储存至少两周后保持清晰响应。与代表性报道的比较（表1和表2）证明了此处实现的实践平衡。在缓冲液中，该传感器将15分钟短检测与低LOD和宽定量范围结合于噬菌体基格式中。在牛奶中，它无需稀释或预富集即可实现低CFU检测，而若干达到相似或更低检测限的方法依赖样品稀释和/或更复杂的工作流程。
编译者解读：该研究的核心创新在于将噬菌体的天然偶极特性转化为工程化优势——电场定向使尾丝受体结合蛋白高效朝向溶液，解决了噬菌体固定取向随机导致捕获效率低的关键瓶颈。ITO电极加硅烷化学的路线成本低、可放大，15分钟免富集检测在牛奶中达到12 CFU/mL，已接近实用门槛。局限在于：T4噬菌体宿主谱窄，实际应用中需针对不同靶菌构建相应噬菌体库；牛奶中LOD低于PBS的机制尚未完全阐明；储存稳定性仅验证两周，长期货架期数据缺乏。若能与微流控样品前处理集成，该平台有望发展为便携式食安检测设备。
参考来源
期刊：Talanta, 2026
DOI: 10.1016/j.talanta.2026.129926
DOI: 10.1016/j.talanta.2026.129926