来源：A paper-based colorimetric biosensor for small-molecule histamine based on synergistic kinetic-relay aptamer recognition and PtFe nanozyme signal amplification（Sensors and Actuators B: Chemical）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
小分子检测中，单一适配体常面临"结合快则亲和力低、亲和力高则结合慢"的两难困境。本研究以海鲜食品安全关键指示物组胺为模型靶标，理性设计了一对协同动力学中继适配体SKRAP——由快速捕获适配体L2和稳定锁定适配体HIS3-T2组成。BLI与分子对接揭示了"先抓后锁"的协同识别机制，配合具有类过氧化物酶活性的PtFe双金属纳米酶构建纸基比色传感器，在10分钟内实现组胺定量检测，线性范围3.05–781.25 nM，检出限2.21 nM。
研究背景
适配体生物传感器因特异性高、化学稳定性好、易于合成和修饰，在小分子分析检测领域备受关注。然而，单个适配体往往在结合亲和力与结合动力学之间存在固有的权衡：高亲和力适配体通常靶标捕获速率慢，影响检测速度；而结合速率快的适配体又常伴随快速解离和结合稳定性不足。这种热力学-动力学的二元矛盾从根本上限制了适配体传感器在小分子快速检测中的分析性能，尤其在需要同时满足快速响应和稳定信号输出的实际应用场景中。
此前少数适配体工程研究尝试通过多价结合策略克服这一限制。例如，Zhao等人利用β-CD@AgNPs同时修饰拉曼信号分子4-MBA和多个适配体检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇，检出限达0.032 pg/mL；Huang等人采用双适配体检测四环素，检出限为0.0073 ng/mL。与单价适配体相比，多价适配体结合位点的增加可部分增强亲和力，但这些方法存在设计不确定性，缺乏理性的机制框架。
研究方法
2.1 材料与试剂
所有寡核苷酸均由生工生物工程（上海）有限公司合成并经HPLC纯化（表S1）。原始L2适配体由Mairal-Lerga等人筛选获得，序列为：ACAGGGAACG TGTTGGTTGC GGTTCTTCCG ATCTGCTGTG TTCT；HIS3-T2适配体由本实验室前期工作构建并优化：TGAGCCCAAG CCCTGGTATG AATGGATTCT CGTTGGGCTG G。这两个适配体因其对组胺的高特异性而被选用。组胺（CAS: 51–45–6）、组氨酸（CAS: 71–00–1）、腐胺（CAS: 333–93–7）、酪胺（CAS: 51–67–2）、尸胺（CAS: 1476–39–7）、精胺（CAS: 71–44–3）、色胺（CAS: 153–98–0）和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）（CAS: 54827–17–7）购自北京索莱宝科技有限公司。甘氨酸（CAS: 56–40–6）、过氧化氢（H₂O₂）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，MW 58000）（CAS: 9003–39–8）、壳聚糖（CS）（CAS: 9012–76–4）、聚乙二醇（PEG）（CAS: 25322–68–3）、聚乙烯醇（PVA）（CAS: 9002–89–5）、海藻酸钠（SA）（CAS: 9005–38–3）购自上海麦克林生化科技有限公司。L-抗坏血酸（CAS: 50–81–7）、四氯铂酸钾（II）（K₂PtCl₄）（CAS: 10025–99–7）、氯化铁（III）（FeCl₃）（CAS: 7705–08–0）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。所有其他试剂均为分析纯。生鲜海鲜、发酵海鲜和干制海鲜购自当地超市（中国青岛）。
【数据】适配体序列：L2为ACAGGGAACG TGTTGGTTGC GGTTCTTCCG ATCTGCTGTG TTCT，HIS3-T2为TGAGCCCAAG CCCTGGTATG AATGGATTCT CGTTGGGCTG G；PVP分子量：58000；其他参数：原文未详述
2.2 适配体亲和力与动力学表征
采用BLI（Octet RED96e，FortéBio，美国）测定单个适配体（L2、HIS3-T2）及SKRAP对组胺的结合亲和力和动力学参数。原始L2适配体对组胺表现出高亲和力和特异性，对其他组胺类似物无响应。将生物素化适配体固定在链霉亲和素包被的传感器尖端直至饱和。在分析缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4，100 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM MgCl₂，1 mM CaCl₂，0.02% Tween-20）中基线稳定后，将芯片浸入系列稀释浓度的组胺溶液（62.5–1000 nM）中监测结合过程180 s，随后在缓冲液中解离180 s。所有测量均在25°C、1000 rpm振荡条件下进行。动力学参数（结合速率常数kon、解离速率常数koff和平衡解离常数Kd）通过结合曲线的全局拟合计算。
【数据】缓冲液：20 mM Tris-HCl，pH 7.4，100 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM MgCl₂，1 mM CaCl₂，0.02% Tween-20；组胺浓度：62.5–1000 nM；结合时间：180 s；解离时间：180 s；温度：25°C；转速：1000 rpm
2.3 适配体与组胺的分子对接
使用AutoDock Vina进行分子对接。L2和HIS3-T2适配体的3D结构使用RNAComposer生成，组胺结构从ZINC数据库（https://zinc15.docking.org/）获取。对接模拟使用覆盖整个适配体结合口袋的网格盒进行。结合能和氢键相互作用使用PyMOL 2.5分析。
【数据】软件：AutoDock Vina、RNAComposer、PyMOL 2.5；数据库：ZINC；其他参数：原文未详述
2.4 PtFe纳米酶的合成与表征
PtFe纳米酶通过一锅还原法合成并稍作修改。典型流程：将20 mM K₂PtCl₄和20 mM FeCl₃加入含8.1 mg甘氨酸和19.8 mg PVP的去离子水中。混合物涡旋10 min，65°C预热5 min。随后在剧烈涡旋下加入新鲜配制的1.0 M L-抗坏血酸，涡旋2 min，反应在65°C下进行2 h。产物通过离心（10000 rpm，15 min）收集，用去离子水洗涤三次。通过评估类过氧化物酶催化活性优化Pt:Fe比例（1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8）。PtFe纳米酶的类过氧化物酶催化活性在10倍稀释后测定，在NaAC缓冲体系中与TMB/H₂O₂反应5 min。初始速率从吸光度-时间曲线前30 s的线性部分计算。形貌和元素分布通过透射电子显微镜（TEM）（Talos F200S G2，Thermo Fisher，美国）检测。粒径分布使用ImageJ 1.54统计分析。晶体结构通过X射线衍射（X′Pert³ MRD，Malvern Panalytical，荷兰）表征，使用Cu Kα辐射（λ = 1.5406 Å），2θ范围5°–85°。表面化学组成和元素价态通过X射线光电子能谱（ESCALAB 250Xi，Thermo Fisher，美国）以Al Kα激发分析。密度泛函理论（DFT）计算使用Materials Studio软件中的第一性原理模拟Cambridge Sequential Total Energy Package（CASTEP）模块进行。交换关联势采用广义梯度近似（GGA）和Perdew-Burke-Ernzerhof（PBE）泛函描述。价电子与离子核之间的相互作用采用OTFG超软赝势方法描述。平面波基组截断能设为400 eV。采用Grimme方案中的经验色散校正考虑范德华（VdW）相互作用。所有能量最小化使用Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shannon（BFGS）算法和中等质量k点设置。几何优化收敛容差为：能量变化5 × 10⁻⁵ eV/atom，最大力0.001 eV/Å，最大位移0.005 Å。所有模型在z轴方向设置20 Å真空层以保证完全弛豫。
【数据】K₂PtCl₄浓度：20 mM；FeCl₃浓度：20 mM；甘氨酸：8.1 mg；PVP：19.8 mg；L-抗坏血酸：1.0 M；涡旋时间：10 min（预混）+ 2 min（还原）；预热温度：65°C；预热时间：5 min；反应温度：65°C；反应时间：2 h；离心：10000 rpm，15 min；Pt:Fe比例：1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:4、1:8；稀释倍数：10倍；TMB/H₂O₂反应时间：5 min；初始速率计算时间：30 s；XRD 2θ范围：5°–85°；Cu Kα波长：1.5406 Å；平面波截断能：400 eV；真空层：20 Å；能量收敛：5 × 10⁻⁵ eV/atom；力收敛：0.001 eV/Å；位移收敛：0.005 Å
2.5 PtFe纳米酶类过氧化物酶活性的稳态动力学测定
PtFe纳米酶的类过氧化物酶活性通过催化TMB和H₂O₂氧化评估。TMB动力学：固定H₂O₂浓度（10 mM），变化TMB浓度（0.02–0.6 mM）。H₂O₂动力学：固定TMB浓度（0.4 mM），变化H₂O₂浓度（0.2–50 mM）。反应通过加入PtFe纳米酶（10倍稀释）启动，使用酶标仪（Multiskan SkyHigh，Thermo Fisher，美国）在652 nm处动力学记录吸光度5 min。初始速率从吸光度-时间曲线前30 s的线性部分计算。随后使用Lineweaver-Burk倒数方程和Michaelis-Menten方程研究米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）。
【数据】TMB动力学：H₂O₂固定浓度10 mM，TMB浓度范围0.02–0.6 mM；H₂O₂动力学：TMB固定浓度0.4 mM，H₂O₂浓度范围0.2–50 mM；检测波长：652 nm；记录时间：5 min；初始速率计算时间：30 s；纳米酶稀释：10倍
2.6 SKRAP@PtFe纳米酶复合物的制备与表征
SKRAP@PtFe纳米酶复合物通过将SKRAP与PtFe纳米酶在37°C孵育60 min形成。随后通过动态光散射（Zetasizer Nano ZS90，Malvern，英国）测定流体力学直径和Zeta电位。通过圆二色光谱（CD）（Jasco-1500，JASCO，日本）研究适配体在靶标结合和纳米酶组装时的构象变化。光谱记录范围220–320 nm，温度25°C，扫描速度20 nm·min⁻¹，带宽1 nm，三次累积。热熔曲线通过监测280 nm处CD信号，在25°C–95°C温度梯度下以1 °C·min⁻¹获得。
【数据】孵育温度：37°C；孵育时间：60 min；CD扫描范围：220–320 nm；扫描温度：25°C；扫描速度：20 nm·min⁻¹；带宽：1 nm；累积次数：3；热熔温度范围：25°C–95°C；升温速率：1 °C·min⁻¹；监测波长：280 nm
2.7 纸基适配体传感器的构建与评估
将Whatman No.1滤纸冲压成均匀圆片（直径6 mm）。比较多种修饰策略：（1）CS-PEG混合物；（2）逐层CS/PEG（0.5% w/v）；（3）逐层PEG/CS；（4）CS/PVA混合物；（5）逐层CS/PVA；（6）逐层PVA/CS；（7）逐层CS/SA；（8）逐层SA/CS；（9）单一CS（0.5% w/v）；（10）空白。表面形貌经金溅射后通过扫描电子显微镜（SEM）（Quanta FEG250，Thermo Fisher，美国）检测。修饰纸的化学组成通过衰减全反射傅里叶变换红外光谱（FTIR-ATR）（Nicolet iS50，Thermo Fisher，美国）分析。亲水性通过静态水接触角测量评估。
【数据】滤纸：Whatman No.1；圆片直径：6 mm；CS/PEG浓度：0.5% w/v；CS浓度：0.5% w/v；其他参数：原文未详述
研究结果
3.1 组胺检测比色纸基生物传感器的方案
将设计的信号识别组件SKRAP与信号转导组件纳米酶结合，构建了所提出的纸基生物传感器（方案1）。适配体1（L2）和适配体2（HIS3-T2）共孵育实现SKRAP组装，随后与PtFe纳米酶孵育。首先，L2与靶标结合触发初始捕获，但这种结合的瞬态性允许潜在的靶标解离。HIS3-T2随后将靶标锁定在位，建立SKRAP系统的动力学中继协同作用（方案1A）。然后将SKRAP@PtFe复合物施加到优化的CS/PEG修饰纸基底上。干燥后，加入不同浓度的靶标反应10 min，随后依次加入TMB和H₂O₂。假设在组胺存在下，靶标诱导的适配体折叠和催化位点的空间位阻降低催化活性，导致颜色变浅。所得颜色强度使用智能手机定量（方案1B）。
【数据】反应时间：10 min；其他参数：原文未详述
3.2 SKRAP对组胺识别的动力学机制分析
通过BLI表征适配体的亲和力和动力学。两种适配体均观察到浓度依赖性结合，响应信号随浓度增加而增加（图1A，L2；图1B，HIS3-T2）。然而，两组的结合和解离阶段表现出不同特征。L2适配体的Kd为174.9 nM（图1D），约为HIS3-T2（59.5 nM）的三倍，表明对组胺的亲和力较低（反比关系）。如图1E所示，L2表现出更高的结合速率常数（kon=4.68 × 10⁵ M⁻¹·s⁻¹），使其能够作为靶标捕获器快速捕获。但其高解离速率常数（koff=8.18 × 10⁻² s⁻¹，图1F）使这种结合本质上不稳定。相比之下，HIS3-T2对靶标表现出高结合亲和力（Kd=59.5 nM）和慢解离速率（koff=1.09 × 10⁻² s⁻¹），允许在靶标从L2释放后稳定隔离靶标。功能上，两种适配体通过平衡热力学和动力学性质实现协同动力学中继。通过组合两种适配体，该SKRAP（图1C）表现出增强的亲和力（Kd=37.8 nM，图1D灰色柱）和更快的结合速率（kon=5.48 × 10⁻⁵ Ms⁻¹）（图1E灰色柱），以及相对降低的解离速率（图1F）。这些数据描绘了从快速结合模式（L2）和高亲和力模式（HIS3-T2）向最优协同动力学中继模式（SKRAP）的转变，实现了结合速率和亲和力之间的平衡（图1G方案）。
为进一步验证这种协同动力学中继机制，进行了结合位点的分子对接分析（图1H）。L2适配体通过其广泛的中心环区域抓住组胺的氨基，暂时捕获靶标。同时，L2适配体的柔性链形态可能增强其瞬态捕获效率。然而，由于仅形成约两个氢键，靶标在捕获后可能解离。相比之下，HIS3-T2适配体采用更直接和决定性的茎环结构锁定组胺咪唑环中的氮原子及其氨基中的氢原子，实现类似于抗体的表位识别和功能互补。这种相互作用涉及约五个氢键，导致更稳定的结合状态。总体而言，一旦靶标从L2适配体逃逸，它很可能被HIS3-T2适配体捕获，使两种适配体形成的SKRAP在靶标结合中实现互补协同或动力学中继。
【数据】L2适配体：Kd=174.9 nM，kon=4.68 × 10⁵ M⁻¹·s⁻¹，koff=8.18 × 10⁻² s⁻¹；HIS3-T2适配体：Kd=59.5 nM，koff=1.09 × 10⁻² s⁻¹；SKRAP：Kd=37.8 nM，kon=5.48 × 10⁻⁵ Ms⁻¹；L2氢键数：约2个；HIS3-T2氢键数：约5个
3.3 PtFe纳米酶的合成与理化表征
基于上述信号识别模块，构建了高活性信号转导组件PtFe纳米酶，用于同时固定适配体并产生比色输出。制备过程如图2A和图S1所示。在整个合成过程中，纳米酶在10 min后趋于完全变黑。在PVP和甘氨酸存在下，Pt²⁺和Fe³⁺前体与稳定剂配位形成复合物。加入L-抗坏血酸后，Pt²⁺优先还原形成晶核，随后Fe³⁺被还原。还原的Fe³⁺沉积到Pt晶核表面或进入晶格，而PVP通过空间位阻控制粒径并防止团聚，最终产生具有Pt-Fe协同界面的双金属纳米酶。优化Pt:Fe比例以实现最大酶活性。尽管终点表现出相似的信号（图S2），但它们具有不同的初始速率，可量化为图2B。纳米酶的初始反应速率随Pt:Fe比例增加而增加，达到平台后下降。Fe的掺入可能促进与Pt的电子相互作用，增强H₂O₂吸附和活化的概率，而Fe参与的类Fenton反应也可促进·OH自由基的产生。此外，Fe的掺入可增加纳米酶的表面缺陷密度，提供更多活性位点。然而，过量的Fe掺入可能导致活性位点被掩蔽。在1:1和1:2比例下，样品产生最快的酶反应速率。考虑经济因素，选择1:1比例作为最终组成。纳米酶的形貌如图2C所示，呈现均匀的团聚结构，众多小颗粒形成较大聚集体，与先前研究中观察到的结构相似。粒径约为28.55 ± 2.86 nm（图S3）。此外，观察到Pt和Fe晶格条纹之间存在明显对比，表明通过这些金属亚颗粒的持续聚集、粘附和组装形成了多孔簇结构。元素分布分析（图2D）显示Pt和Fe均匀分布在整个聚集体中，Pt占多数（蓝色，95.85%），Fe占少数（红色，4.15%）。图S4显示XRD图谱中（111）、（200）、（220）和（311）处的典型衍射峰，表明纳米酶呈现典型的面心立方（fcc）相结构。X射线光电子能谱（XPS）扫描（图S5）还识别出对应于Fe 2p、O 1s、N 1s、Pt 4d和Pt 4f的信号，与上述Pt²⁺还原为Pt⁰和Fe³⁺部分还原为Fe²⁺一致。合成的纳米酶表现出均匀的形貌和元素分布。其球形多孔结构为SKRAP固定和H₂O₂活性位点提供了丰富的位点，使其非常适合后续应用。
【数据】合成变色时间：10 min；粒径：28.55 ± 2.86 nm；Pt含量：95.85%；Fe含量：4.15%；Pt:Fe优化比例：1:1和1:2（最终选1:1）；XRD衍射峰：（111）、（200）、（220）、（311）；XPS信号：Fe 2p、O 1s、N 1s、Pt 4d、Pt 4f
3.4 PtFe纳米酶类过氧化物酶活性的稳态动力学测定
PtFe纳米酶具有显著的过氧化物酶活性但氧化酶活性较弱（图S6）。值得注意的是，10倍稀释的纳米酶极大优于未稀释的AuNP对照，证明其优越的催化效率。PtFe纳米酶的稳态动力学分析如图3A所示，通过方程拟合获得的相应参数列于表S2。PtFe纳米酶表现出典型的Michaelis-Menten动力学特征，对TMB的Km值为0.19 mM，Vmax值为1.27 × 10⁻⁶ M·s⁻¹；对H₂O₂的Km值为9.43 mM，Vmax值为——
【数据】TMB：Km=0.19 mM，Vmax=1.27 × 10⁻⁶ M·s⁻¹；H₂O₂：Km=9.43 mM；稀释倍数：10倍；检测波长：652 nm
讨论与解读
本研究通过理性组合快速结合适配体（L2，捕获适配体）与高亲和力适配体（HIS3-T2，锁定适配体），开发了称为SKRAP的适配体对，有效克服了限制单适配体识别能力的热力学-动力学固有矛盾。系统性BLI表征证实，与单个适配体相比，SKRAP表现出增强的表观亲和力、加速的结合动力学和部分抑制的解离特性，为协同靶标捕获和稳定锁定奠定了动力学基础。分子对接结果进一步揭示了SKRAP靶标结合位点处动力学中继的直接或间接协同互补相互作用。该SKRAP进一步整合了模拟过氧化物酶的PtFe双金属纳米酶，形成双模块纳米复合物。靶标诱导的适配体构象变化调节纳米酶的催化活性，通过"信号关闭"比色反应实现高灵敏组胺定量。通过将该识别-转导模块固定在层状自组装CS/PEG纸基底上，构建了能够在10 min内定量组胺的纸基生物传感器。该传感器实现了3.05–781.25 nM的线性检测范围和2.21 nM的检出限，对结构相似的生物胺表现出优异的选择性，在生鲜和加工海鲜中显示出令人满意的准确性。
编译者解读：该研究的方法学价值在于将适配体工程中的"热力学-动力学权衡"问题转化为可设计的双适配体协同方案——不是简单叠加多价结合，而是通过动力学参数互补（快结合+慢解离）实现功能分工。PtFe纳米酶的引入使信号转导与识别模块解耦，纸基+智能手机的检测形式则贴合现场快检需求。局限在于：SKRAP设计仍依赖对单个适配体动力学参数的预先表征，对未知靶标适配体的通用性有待验证；纸基传感器的批间一致性和长期稳定性未在节选中充分呈现。
参考来源
期刊：Sensors and Actuators B: Chemical, 2026
DOI: 10.1016/j.snb.2026.140666
DOI: 10.1016/j.snb.2026.140666