来源：A multimodal biosensor based on DNAzyme signal amplification strategy for the detection of lincomycin drug residues（Microchemical Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
林可霉素（LIN）残留威胁食品安全与公众健康。本研究构建了一种多模态生物传感器，利用Ag⁺-DNAzyme的循环切割活性与金纳米粒子（AuNPs）的光学特性，将LIN识别事件转化为比色、廷德尔效应（TE）和荧光三种同步信号。该方法线性范围宽、检测限低至9.86 × 10⁻⁴ μg/L，为抗生素残留的现场快速检测提供了新方案。
研究背景
林可霉素是由林可链霉菌发酵产生的林可酰胺类抗生素，能有效抑制革兰氏阳性菌的蛋白质合成，广泛用于人类和动物的细菌感染治疗。畜牧养殖中过量使用林可霉素，不仅会导致其在食用动物体内生物累积，还可通过食物链传递至人体，诱发耐药基因产生、神经损伤、肝毒性和肾毒性等不良后果。为保障人畜健康与环境安全，多国已制定林可霉素的最大残留限量（MRLs）。例如，中国规定牛、羊、猪和家禽脂肪组织中LIN的MRL不得超过100 μg/kg；欧盟规定鸡蛋中LIN的MRL不超过50 μg/kg，动物肾脏中不超过1500 μg/kg。目前食品中LIN的主要检测方法包括色谱法和增强化学发光法。这些方法虽较成熟且灵敏度、选择性良好，但存在需大型设备、无法现场检测、样品前处理复杂等不足。为克服这些局限，新兴生物传感策略不断涌现，本研究即在此背景下提出了一种基于Ag⁺-DNAzyme信号放大与AuNPs光学特性的多模态传感方案。
研究方法
2 实验部分 实验所需仪器设备及实验材料与制备的详细信息见补充材料2.1至2.4节。
2.1 LIN的多模态检测
将等体积的10 μmol/L底物DNA（S-DNA）与5 μmol/L Ag⁺-DNAzyme混合。反应混合物在基因扩增仪中于95 °C孵育5 min，随后以每90 s降低1 °C的速率缓慢冷却至室温。退火后，所得溶液包含两种组分：S-DNA与Ag⁺-DNAzyme通过碱基互补配对形成的dsDNA结构，以及未能与Ag⁺-DNAzyme结合形成双链DNAzyme结构的未反应S-DNA。在另一微量离心管中，将5 μL的2.5 μmol/L LIN适配体与5 μL的42.5 μmol/L Ag⁺混合。混合物在环境温度、避光条件下孵育2 h，促进适配体内C-Ag⁺-C错配结构的形成。随后，向上述溶液中加入5 μL不同浓度的LIN溶液，体系在37 °C孵育1 h，使LIN与适配体发生特异性结合（该结合破坏C-Ag⁺-C结构并释放游离Ag⁺）。接着，依次向体系中加入10 μL上述退火后溶液和15 μL MOPS缓冲液，于室温孵育1.5 h，以触发活化Ag⁺-DNAzyme对S-DNA的循环切割。
【数据】S-DNA浓度：10 μmol/L；Ag⁺-DNAzyme浓度：5 μmol/L；退火温度：95°C；退火时间：5 min；冷却速率：1°C/90 s；适配体浓度：2.5 μmol/L；适配体体积：5 μL；Ag⁺浓度：42.5 μmol/L；Ag⁺体积：5 μL；C-Ag⁺-C形成温度：环境温度；C-Ag⁺-C形成时间：2 h；LIN孵育温度：37°C；LIN孵育时间：1 h；循环切割温度：室温；循环切割时间：1.5 h；MOPS缓冲液体积：15 μL
2.2 比色检测
将40 μL上述反应溶液（含5 μL Ag⁺、5 μL LIN适配体、5 μL不同浓度LIN标准品、10 μL退火DNAzyme结构溶液和15 μL MOPS缓冲液pH 7.5）与500 μL AuNPs混合。随后，加入80 μL的225 mmol/L NaNO₃水溶液，反应混合物孵育5 min。对所得溶液在520 nm和650 nm处进行定量紫外-可见吸收测量，系统记录吸光度比值（A₅₂₀/A₆₅₀）的相对变化。
【数据】反应溶液体积：40 μL；AuNPs体积：500 μL；NaNO₃浓度：225 mmol/L；NaNO₃体积：80 μL；孵育时间：5 min；检测波长：520 nm、650 nm；MOPS缓冲液pH：7.5
2.3 廷德尔效应（TE）检测
为确保暗箱具有良好的遮光效果，避免拍摄过程中受其他外部光线影响。如（图S1）所示，在暗箱外部固定一个与HUAWEI Pura 70 Pro型号匹配的智能手机卡槽，暗箱内壁衬有黑色遮光纸以确保完全光隔离。箱内固定一个635 nm红色激光器，确保激光束垂直照射2 mL透明玻璃瓶中的样品。此外，在智能手机成像过程中，暗箱用黑布覆盖，以确保黑暗环境并防止激光折射干扰TE信号。按照上述反应步骤，将最终反应溶液转移至玻璃瓶中并置于暗箱内。打开激光器，将智能手机设置为"多云"模式，ISO值为200，拍摄TE图像。使用Photoshop软件提取图像，确保每次提取的部分尽可能一致，然后将图像保存为JPG格式。在ImageJ软件中，选择"Analyze"->"Set Measurements"，然后选择"Mean gray value"。将处理后的照片拖入ImageJ软件，点击"Analyze"->"Measure"分析照片的平均灰度值（mean gray value, MGA），以此值作为TE强度的测量指标。
【数据】激光波长：635 nm；样品体积：2 mL；智能手机型号：HUAWEI Pura 70 Pro；ISO值：200；拍摄模式：Cloudy；图像格式：JPG
2.4 荧光检测
将GCDs溶液按1:1.86的比例加入超纯水稀释。然后，按照上述步骤2.5，将500 μL稀释后的GCDs溶液加入最终反应溶液中。混合物反应5 min。使用荧光光谱仪记录在400 nm激发波长下515 nm处的荧光强度变化。
【数据】GCDs稀释比例：1:1.86；GCDs溶液体积：500 μL；反应时间：5 min；激发波长：400 nm；发射波长：515 nm
研究结果
3 结果与讨论
3.1 AuNPs的表征
AuNPs的尺寸分布和分散性可通过透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）和紫外-可见（UV–Vis）吸收光谱进行评价。如（图1A）所示，AuNPs呈球形形态，均匀分散在溶液中。这种均匀分散归因于合成AuNPs所用的柠檬酸钠还原法。在此过程中，柠檬酸根阴离子吸附在AuNPs表面，赋予其负电荷。这些表面电荷吸引溶液中的正离子，形成稳定的双电层。当AuNPs相互靠近时，其双电层重叠，产生强静电排斥力。这种排斥力维持了AuNPs的稳定分散。然而，用适当浓度的盐、表面活性剂或阳离子聚合物处理后，AuNPs的表面负电荷被中和（图1B）。这种中和削弱了颗粒间的静电排斥；此外，随着AuNPs表面电荷积累，颗粒间的范德华吸引力开始占主导地位，最终导致纳米颗粒聚集。 （图1C）展示了AuNPs的DLS分布，表明平均粒径约为23.5 nm。 （图1D）显示AuNPs的紫外吸收峰位于520 nm，与先前文献报道一致，进一步证实了AuNPs的成功合成。
【数据】AuNPs平均粒径：约23.5 nm；紫外吸收峰：520 nm；AuNPs形貌：球形；合成方法：柠檬酸钠还原法
3.2 GCDs的表征
通过TEM对水热法合成的GCDs的形貌进行了表征。TEM图像（图1E）显示，合成的GCDs呈球形形态，具有良好的单分散性。HRTEM图像（图1E插图）显示GCDs具有晶格条纹，表明其良好的结晶性。晶格间距约为0.20 nm，对应于石墨碳的（100）晶面。该结果证实GCDs具有类石墨晶体结构。如DLS尺寸分布（图1F）所示，GCDs的平均流体动力学直径为3.4 nm。利用FT-IR光谱表征了所制备GCDs的表面官能团（图1G）。在3445 cm⁻¹、1672 cm⁻¹、1501 cm⁻¹和1400 cm⁻¹处的特征吸收峰分别归属于O-H/N-H、C=O/C=N、C-O和C-H的伸缩振动，表明GCDs表面富含O和N官能团。通过X射线光电子能谱（XPS）进一步研究了GCDs的组成。XPS全谱（图2A）显示GCDs含有三种元素：C（285 eV）、N（400 eV）和O（532 eV），其元素含量分别为69.2%、12.8%和18.1%。这些元素分布证实GCDs是掺杂少量N和O的碳基纳米材料。通过拟合C 1 s的高分辨谱，得到三个峰（图2B），分别为C-C/C=C（285.2 eV）、C-N/C-O（286.6 eV）和C=O（288.9 eV）。N 1 s谱（图2C）分为两个峰：398.8 eV（吡啶型N，C-N）和400.7 eV（吡咯型N，N-H），来源于前驱体的含氮官能团。O 1 s谱（图2D）显示两个峰，分别位于531.9 eV（羰基氧，C=O）和533.1 eV（羟基/醚氧，C-O）。XPS结果与FT-IR结果一致，表明GCDs表面富含羟基和氨基。
【数据】GCDs平均流体动力学直径：3.4 nm；晶格间距：约0.20 nm；晶面：（100）；FT-IR特征峰：3445、1672、1501、1400 cm⁻¹；XPS元素含量：C 69.2%、N 12.8%、O 18.1%；C 1 s峰：285.2、286.6、288.9 eV；N 1 s峰：398.8、400.7 eV；O 1 s峰：531.9、533.1 eV
3.3 实验条件优化
多模态生物传感器所有实验条件的优化见补充材料3.1。
【数据】原文未详述
3.4 多模态生物传感器检测LIN的机理与可行性分析
首先，通过紫外-可见吸收光谱、荧光光谱和荧光寿命研究了AuNPs猝灭GCDs的机理。图3A显示，AuNPs在分散态（曲线c）和聚集态（曲线d）的紫外吸收光谱均与GCDs的激发光谱（曲线a）和发射光谱（曲线b）存在显著重叠。这表明AuNPs对GCDs的猝灭效应可能由荧光共振能量转移（FRET）或内滤效应（IFE）引起。为阐明AuNPs对GCDs的猝灭机理，首先进行了荧光寿命分析。如（图3B）所示，加入AuNPs前后GCDs的平均荧光寿命值保持不变，平均值为3.20 ns。该观察排除了FRET的动态猝灭机制。随后的UV–Vis吸收光谱测量进一步验证了IFE的静态猝灭性质。如图3C所示，当AuNPs与GCDs混合时，混合物的UV–Vis光谱未出现新的吸收峰，仅为AuNPs和GCDs各自光谱的叠加。这表明AuNPs对GCDs的荧光猝灭由IFE引起。从机理上讲，单分散的AuNPs由于其与GCDs的广泛光谱重叠而作为高效竞争吸收体，导致强IFE猝灭。然而，盐诱导的聚集触发AuNP吸收带的显著红移，大幅降低光谱重叠积分并缓解IFE，从而恢复荧光。为验证基于Ag⁺-DNAzyme放大信号的多模态生物传感器检测LIN的可行性，我们分析了TE、比色和荧光三种模式下AuNPs的聚集状态。分散的AuNP溶液呈红色，在520 nm处具有特征性UV–Vis吸收峰（图3D，曲线a）。然而，由于盐诱导的聚集效应，向体系中加入NaNO₃水溶液并与AuNPs均匀混合后，AuNPs聚集，导致溶液颜色从红色变为蓝色。值得注意的是，520 nm处的特征紫外吸收峰显著降低，同时在650 nm处出现新的紫外吸收带（图3D，曲线b）。如（图3D曲线c）及其插图所示，当LIN引入反应体系时，即使在高盐条件下AuNPs仍保持分散，维持红色和在520 nm处的明显吸收峰。在LIN存在下，AuNPs在高盐环境中未发生聚集。然而，在相同实验条件下，若不加入LIN，可清晰观察到体系溶液呈蓝色，其紫外吸收峰与曲线b相似，表明AuNPs在高盐环境中发生了聚集（图3D，曲线d）。这些结果表明适配体与LIN特异性结合。在高热力学亲和力和精确空间匹配的驱动下，这种靶标识别诱导构象转换，竞争性破坏C-Ag⁺-C错配。因此，游离Ag⁺被释放以激活Ag⁺-DNAzyme，导致S-DNA被切割并产生大量短DNA链。这些柔性单链DNA片段保护AuNPs免受盐诱导聚集，从而维持其分散状态。AuNPs是典型的胶体颗粒，其光散射效率与聚集状态密切相关。如（图3E）及相应插图所示，用635 nm激光照射（图3D）中描述的相同四种溶液以捕获TE图像，并分析其平均灰度值（MGV）。结果表明，分散态的AuNPs和反应体系中加入LIN后由短DNA链保护的AuNPs均未显示出明显光路，MGV值较低。这证明向反应体系中加入LIN可有效触发高盐环境中AuNPs聚集状态的改变。
【数据】GCDs平均荧光寿命：3.20 ns；AuNPs分散态吸收峰：520 nm；AuNPs聚集态吸收峰：650 nm；激发波长：635 nm（TE激光）；荧光激发波长：400 nm；荧光发射波长：515 nm
讨论与解读
4 结论
我们开发了一种集成循环信号放大技术的多模态生物传感器，利用LIN适配体对LIN的特异性识别、Ag⁺-DNAzyme对S-DNA的循环切割活性以及AuNPs的光学特性，实现了LIN的特异性检测。在该多模态生物传感器中，LIN的存在触发级联反应：LIN特异性结合LIN适配体，诱导Ag⁺从C-Ag⁺-C配位结构中释放。释放的Ag⁺激活Ag⁺-DNAzyme，使其循环催化切割S-DNA为两条游离短链DNA。这种循环切割产生大量短DNA链，调控高盐环境中AuNPs的聚集状态。AuNPs聚集状态的改变显著放大体系中比色/TE/荧光信号的变化，实现LIN的高灵敏检测。该多模态生物传感器对LIN表现出宽检测范围和低LOD。具体而言，TE法、比色法和荧光法对LIN的检测范围分别为1.00 × 10⁻²–1.00 × 10³ μg/L、1.00 × 10⁻²–1.00 × 10² μg/L和5.00 × 10⁻³–1.00 × 10³ μg/L，相应LOD分别为6.20 × 10⁻³ μg/L、8.73 × 10⁻³ μg/L和9.86 × 10⁻⁴ μg/L。此外，该生物传感器在实际样品检测中表现出良好的准确性和实用性，也适用于现场检测。
编译者解读
该研究将Ag⁺-DNAzyme循环放大与AuNPs的三种光学响应巧妙耦合，核心亮点在于"一靶三读"——同一识别事件同步输出比色、TE和荧光信号，有效规避单模式检测的环境干扰与假阳性风险。TE模式借助智能手机成像即可完成，具备现场检测潜力。局限在于实际样品基质效应尚未充分验证，且多模态同步操作对流程标准化要求较高。整体而言，该策略为抗生素残留的便携式多通道检测提供了可借鉴的分子设计范式。
参考来源
期刊：Microchemical Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.microc.2026.119666
DOI: 10.1016/j.microc.2026.119666