来源：An electrochemiluminescence biosensor based on the hairpin-mediated exponential amplification and CRISPR/Cas12a amplification for ultrasensitive detection of MMP-2（Colloids and Surfaces B: Biointerfaces）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
基质金属蛋白酶-2（MMP-2）是肿瘤侵袭与转移的重要生物标志物，但其在复杂生物样本中丰度极低，传统检测方法难以兼顾灵敏度与特异性。本研究构建了一种新型电化学发光（ECL）生物传感器，将MMP-2特异性肽切割、发夹介导的指数扩增反应（HMEA）与CRISPR/Cas12a的反式切割活性串联，并借助DNA四面体修饰的PEI-Ti₃C₂Tx/Ru/AuNPs纳米复合电极实现信号转导。该传感器在0.01 fM至10 nM范围内呈良好线性，检测限低至10 aM，在细胞培养上清中回收率为96.9%–105.0%。
研究背景
MMP-2属于基质金属蛋白酶家族，是一种锌依赖性内肽酶，在细胞外基质降解与组织重塑中发挥核心作用。在心血管疾病中，MMP-2参与血管重塑、动脉粥样硬化斑块不稳定及心肌损伤。MMP-2活性失调还与神经退行性疾病、慢性炎症以及皮肤老化（如皱纹和弹性丧失）相关。因此，精确测量MMP-2活性对临床诊断和治疗决策至关重要。传统方法如ELISA、明胶酶谱法和Western blotting虽被广泛使用，但存在灵敏度不足、流程复杂耗时、无法区分潜伏型与活性型MMP-2等缺陷。电化学发光（ECL）检测在监测MMP-2等生物分子方面具有独特优势，其超低背景噪声使其成为传统分析方法的有力替代方案。
研究方法
2.1 材料与化学试剂
Ti₃C₂Tx分散液购自江苏先丰纳米材料科技有限公司（中国南京）。聚乙烯亚胺（PEI，支化型，Mw ≈ 25,000）、三(2,2'-联吡啶)钌氯化物Ru(bpy)₃²⁺、氯金酸（HAuCl₄·4H₂O）、三(2-羧乙基)膦（TCEP）、6-巯基-1-己醇（MCH）以及用于选择性实验的重组人MMP-2蛋白和相关蛋白酶均购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。所有DNA寡核苷酸，包括发夹探针、DT支架和二茂铁（Fc）修饰的DNA探针，均由生工生物工程（上海）股份有限公司定制合成并经HPLC纯化。可被MMP-2特异性切割的肽底物（GPLG↓VRGK）由吉尔生化（上海）有限公司合成。LbCas12a核酸酶和合成gRNA购自New England Biolabs（美国NEB）。DNA聚合酶由Takara Bio（中国大连）提供。所有水溶液均使用Millipore Milli-Q纯化系统制备的超纯水（18.2 MΩ·cm）配制。除非另有说明，所有化学品和试剂均为分析纯，使用前未经进一步纯化。
【数据】PEI分子量：Mw ≈ 25,000；超纯水电阻率：18.2 MΩ·cm；肽底物序列：GPLG↓VRGK；试剂来源：Sigma-Aldrich、Sangon Biotech、GL Biochem、NEB、Takara Bio
2.2 仪器与装置
采用常规三电极体系，由玻碳电极（工作电极）、Ag/AgCl（饱和KCl）参比电极和铂丝对电极组成。ECL测量在CHI660E电化学工作站（中国CH Instruments）上进行，耦合垂直于电极表面放置的光电倍增管（PMT，日本Hamamatsu）进行发光检测。除非另有说明，所有电化学实验均在室温环境条件下进行。
【数据】工作电极：玻碳电极；参比电极：Ag/AgCl（饱和KCl）；对电极：铂丝；仪器：CHI660E电化学工作站；检测器：PMT（Hamamatsu，日本）；温度：室温
2.3 ECL生物传感器检测MMP-2的工作原理
方案1展示了所提出的ECL生物传感器检测MMP-2的整体工作机制。该过程可分为四个连续模块，每个模块代表信号转换、放大和读出的关键功能阶段。
方案1a描述了MMP-2触发探针激活的策略。系统始于一个特殊设计的HP1，由PNA起始链与封闭PNA链杂交而成，二者通过可被MMP-2特异性切割的短肽底物连接。在完整形态下，起始PNA被封闭在类似发夹的闭合结构中，无法参与下游反应。当MMP-2存在时，肽底物被水解，导致起始PNA释放。该步骤将酶促蛋白水解转化为核酸信号，作为初级激活事件。
方案1b是发夹介导延伸的指数扩增过程。一旦释放，起始PNA与HP2杂交，引起局部打开和引物延伸。该过程产生含有新序列基序的延伸产物（EHP1），使其能够进一步分子内折叠形成EHP2。延伸和链置换反应迭代进行，产生多个延长发夹产物（EHPx）并持续再生起始子，从而实现高效初级扩增。通过该级联反应，单个MMP-2切割事件被指数放大为含有重复识别位点的大量DNA纳米结构。
延伸产物EHPx嵌入PAM位点和互补靶序列，被Cas12a/gRNA复合物特异性识别，如方案1c所示。结合这些序列后，Cas12a被激活并释放旁切单链DNA反式切割活性，从而启动次级扩增过程。这种强大的酶功能不加区分地切割附近的单链DNA报告探针，产生第二层信号放大。由于EHPx含有多个Cas12a识别位点，众多Cas12a酶可被平行激活，显著提高检测的灵敏度和效率。
方案1d展示了通过纳米结构界面产生ECL信号的过程。对于信号读出，传感界面由PEI-Ti₃C₂Tx/Ru/AuNPs杂化纳米复合材料构建。Ti₃C₂Tx MXene纳米片提供大表面积和优异导电性，PEI有助于表面修饰和电荷平衡，Ru配合物作为稳健的ECL发射体，Au纳米颗粒促进探针稳定固定。在该功能基底上，DT通过Au-S键锚定，直立于电极表面。每个四面体顶点定位一个Fc标记探针。在初始状态下，Fc分子靠近电极表面，猝灭Ru基ECL信号，系统处于"ECL-OFF"状态。一旦Cas12a被激活，ssDNA探针的旁切将Fc标记链从四面体上移除。这种空间分离释放了猝灭效应，将ECL信号转为"ON"。信号强度与样品中活性MMP-2浓度直接相关。
总体而言，该方案优雅地将蛋白酶特异性切割、PNA介导的起始、发夹驱动的指数扩增、CRISPR/Cas12a旁切以及基于MXene的ECL信号转导整合到单一传感级联中。每一步都提供特异性和放大，使该平台能够实现对复杂生物环境中MMP-2的超高灵敏度、优异选择性和快速检测。
【数据】HP1组成：PNA起始链+封闭PNA链+肽底物（GPLG↓VRGK）；扩增产物：EHPx；电极材料：PEI-Ti₃C₂Tx/Ru/AuNPs；锚定方式：Au-S键；初始状态：ECL-OFF；激活后：ECL-ON
2.4 PEI-Ti₃C₂Tx/Ru/AuNPs纳米复合材料的表征
图1A显示了剥离的Ti₃C₂Tx MXene纳米片的透射电子显微镜图像。纳米片呈现薄层状形态，横向尺寸为数十纳米。透明和重叠的结构证实了其超薄二维性质，提供了大表面积和丰富的表面末端基团（–O、–OH），有利于后续功能化。清晰的层状堆叠结构是MXene的特征，横向褶皱突出了其柔韧性。
图1B显示了Ti₃C₂Tx经聚乙烯亚胺、Ru配合物和AuNPs表面修饰后的TEM图像。与裸Ti₃C₂Tx相比，图像显示纳米片表面分布着大量暗对比点，对应于分散良好的Au纳米颗粒。AuNPs的成功装饰表明PEI的有效锚定，而Ru配合物嵌入杂化基质中。这种修饰增强了导电性和电化学发光性能，创建了多功能传感基底。
图1C显示了纳米复合材料的能量色散X射线光谱（EDS）元素映射。中心明场电子图像突出了均匀分布的纳米颗粒。尽管轻元素（如C、N和O）的元素映射信号由于TEM-EDS分析的固有局限性而表现出相对较低的对比度，但整体元素分布仍与纳米复合材料的成功组装一致。N元素表明纳米片表面存在PEI分子。Ru元素反映了Ru配合物在整个框架中的固定。O元素和C元素来自Ti₃C₂Tx表面末端和MXene骨架。Ti元素证实了MXene基底。Au元素显示明显、均匀分散的纳米颗粒。
这些观察结果进一步得到补充的UV-Vis、XPS、Zeta电位和AFM表征的证实。如图S1A所示，PEI-Ti₃C₂Tx/Ru/AuNPs复合物的光谱在约300 nm和475 nm处显示特征吸收峰，可归因于Ru(dcbpy)₃²⁺-聚乙烯亚胺组分。此外，在约525 nm处观察到明显的吸收峰，对应于Au纳米颗粒的局域表面等离子体共振（LSPR）。这些特征吸收峰的共存证实了Ru(dcbpy)₃²⁺和AuNPs成功整合到Ti₃C₂/PEI平台上，从而验证了PEI-Ti₃C₂Tx/Ru/AuNPs纳米复合材料的成功构建。
XPS调查谱进一步证实了纳米复合材料的元素组成（图S1B）。除来自Ti₃C₂Tx的Ti、C和O信号外，还清晰观察到对应于N 1s（来自PEI）、Ru 3p/3d（来自Ru配合物）和Au 4f（来自AuNPs）的明显峰，验证了各组分的成功掺入。
Zeta电位测量（图S1C）显示，Ti₃C₂Tx的表面电位为负值（约−30 mV），经PEI修饰后由于引入大量胺基而转变为正值（约+24 mV）。进一步负载Ru和AuNPs后，Zeta电位降至约+10 mV，表明由静电相互作用和部分电荷中和驱动的成功组装。
进行AFM表征以研究Ti₃C₂Tx纳米片上Au纳米颗粒的表面形态和分散情况。如图S1D所示，Ti₃C₂Tx基底呈现特征性超薄层状结构，而大量对应于AuNPs的明亮突起均匀分布在纳米片表面。纳米颗粒看起来分散良好，无明显聚集，高度对比表明AuNPs的成功负载。AFM图像中观察到的纳米颗粒横向尺寸与TEM测量结果一致（约10–20 nm），证实了AuNPs在Ti₃C₂Tx纳米片上的有效固定。
【数据】Ti₃C₂Tx表面电位：约−30 mV；PEI修饰后：约+24 mV；Ru/AuNPs负载后：约+10 mV；UV-Vis吸收峰：约300 nm、475 nm、525 nm；AuNPs尺寸：约10–20 nm；表征方法：TEM、EDS、UV-Vis、XPS、Zeta电位、AFM
2.5 荧光动力学验证实验
图2A显示了不同组分省略条件下的荧光动力学。只有含有MMP-2、Bst聚合酶、Cas12a和gRNA的完整系统产生了强烈的荧光增加，而省略任何单一组分（MMP-2、Cas12a、gRNA或Bst聚合酶）或空白样品均导致荧光信号显著降低或无显著变化。该结果证实了各组分在级联反应中的必要性。
【数据】完整系统组分：MMP-2、Bst聚合酶、Cas12a、gRNA；省略任一组分：荧光信号显著降低或无显著变化
2.6 ECL生物传感器的分析性能
图3A显示了生物传感器在不同MMP-2浓度（0.01 fM至10 nM）下记录的时间分辨ECL响应。图3B显示了相同实验条件下获得的电位依赖性ECL曲线。发射峰出现在约1.2 V附近，对应于PEI-Ti₃C₂Tx/Ru/AuNPs电极上Ru中心的氧化。
【数据】MMP-2浓度范围：0.01 fM至10 nM；ECL发射峰电位：约1.2 V；电极：PEI-Ti₃C₂Tx/Ru/AuNPs
2.7 选择性、稳定性与实际样品检测
该生物传感器对干扰蛋白（凝血酶、IgG、BSA、溶菌酶）表现出高特异性，具有优异的稳定性，在LO2细胞培养上清中获得了满意的回收率（96.9%–105.0%）。
【数据】干扰蛋白：凝血酶、IgG、BSA、溶菌酶；回收率：96.9%–105.0%；实际样品：LO2细胞培养上清
研究结果
3.1 ECL生物传感器检测MMP-2的原理
方案1展示了所提出的ECL生物传感器检测MMP-2的整体工作机制。该过程可分为四个连续模块，每个模块代表信号转换、放大和读出的关键功能阶段。
方案1a描述了MMP-2触发探针激活的策略。系统始于一个特殊设计的HP1，由PNA起始链与封闭PNA链杂交而成，二者通过可被MMP-2特异性切割的短肽底物连接。在完整形态下，起始PNA被封闭在类似发夹的闭合结构中，无法参与下游反应。当MMP-2存在时，肽底物被水解，导致起始PNA释放。该步骤将酶促蛋白水解转化为核酸信号，作为初级激活事件。
方案1b是发夹介导延伸的指数扩增过程。一旦释放，起始PNA与HP2杂交，引起局部打开和引物延伸。该过程产生含有新序列基序的延伸产物（EHP1），使其能够进一步分子内折叠形成EHP2。延伸和链置换反应迭代进行，产生多个延长发夹产物（EHPx）并持续再生起始子，从而实现高效初级扩增。通过该级联反应，单个MMP-2切割事件被指数放大为含有重复识别位点的大量DNA纳米结构。
延伸产物EHPx嵌入PAM位点和互补靶序列，被Cas12a/gRNA复合物特异性识别，如方案1c所示。结合这些序列后，Cas12a被激活并释放旁切单链DNA反式切割活性，从而启动次级扩增过程。这种强大的酶功能不加区分地切割附近的单链DNA报告探针，产生第二层信号放大。由于EHPx含有多个Cas12a识别位点，众多Cas12a酶可被平行激活，显著提高检测的灵敏度和效率。
方案1d展示了通过纳米结构界面产生ECL信号的过程。对于信号读出，传感界面由PEI-Ti₃C₂Tx/Ru/AuNPs杂化纳米复合材料构建。Ti₃C₂Tx MXene纳米片提供大表面积和优异导电性，PEI有助于表面修饰和电荷平衡，Ru配合物作为稳健的ECL发射体，Au纳米颗粒促进探针稳定固定。在该功能基底上，DT通过Au-S键锚定，直立于电极表面。每个四面体顶点定位一个Fc标记探针。在初始状态下，Fc分子靠近电极表面，猝灭Ru基ECL信号，系统处于"ECL-OFF"状态。一旦Cas12a被激活，ssDNA探针的旁切将Fc标记链从四面体上移除。这种空间分离释放了猝灭效应，将ECL信号转为"ON"。信号强度与样品中活性MMP-2浓度直接相关。
总体而言，该方案将蛋白酶特异性切割、PNA介导的起始、发夹驱动的指数扩增、CRISPR/Cas12a旁切以及基于MXene的ECL信号转导整合到单一传感级联中。每一步都提供特异性和放大，使该平台能够实现对复杂生物环境中MMP-2的超高灵敏度、优异选择性和快速检测。
【数据】HP1组成：PNA起始链+封闭PNA链+肽底物（GPLG↓VRGK）；扩增产物：EHPx；电极材料：PEI-Ti₃C₂Tx/Ru/AuNPs；锚定方式：Au-S键；初始状态：ECL-OFF；激活后：ECL-ON
3.2 PEI-Ti₃C₂Tx/Ru/AuNPs纳米复合材料的表征
图1A显示了剥离的Ti₃C₂Tx MXene纳米片的透射电子显微镜图像。纳米片呈现薄层状形态，横向尺寸为数十纳米。透明和重叠的结构证实了其超薄二维性质，提供了大表面积和丰富的表面末端基团（–O、–OH），有利于后续功能化。清晰的层状堆叠结构是MXene的特征，横向褶皱突出了其柔韧性。
图1B显示了Ti₃C₂Tx经聚乙烯亚胺、Ru配合物和AuNPs表面修饰后的TEM图像。与裸Ti₃C₂Tx相比，图像显示纳米片表面分布着大量暗对比点，对应于分散良好的Au纳米颗粒。AuNPs的成功装饰表明PEI的有效锚定，而Ru配合物嵌入杂化基质中。这种修饰增强了导电性和电化学发光性能，创建了多功能传感基底。
图1C显示了纳米复合材料的能量色散X射线光谱（EDS）元素映射。中心明场电子图像突出了均匀分布的纳米颗粒。尽管轻元素（如C、N和O）的元素映射信号由于TEM-EDS分析的固有局限性而表现出相对较低的对比度，但整体元素分布仍与纳米复合材料的成功组装一致。N元素表明纳米片表面存在PEI分子。Ru元素反映了Ru配合物在整个框架中的固定。O元素和C元素来自Ti₃C₂Tx表面末端和MXene骨架。Ti元素证实了MXene基底。Au元素显示明显、均匀分散的纳米颗粒。
这些观察结果进一步得到补充的UV-Vis、XPS、Zeta电位和AFM表征的证实。如图S1A所示，PEI-Ti₃C₂Tx/Ru/AuNPs复合物的光谱在约300 nm和475 nm处显示特征吸收峰，可归因于Ru(dcbpy)₃²⁺-聚乙烯亚胺组分。此外，在约525 nm处观察到明显的吸收峰，对应于Au纳米颗粒的局域表面等离子体共振（LSPR）。这些特征吸收峰的共存证实了Ru(dcbpy)₃²⁺和AuNPs成功整合到Ti₃C₂/PEI平台上，从而验证了PEI-Ti₃C₂Tx/Ru/AuNPs纳米复合材料的成功构建。
XPS调查谱进一步证实了纳米复合材料的元素组成（图S1B）。除来自Ti₃C₂Tx的Ti、C和O信号外，还清晰观察到对应于N 1s（来自PEI）、Ru 3p/3d（来自Ru配合物）和Au 4f（来自AuNPs）的明显峰，验证了各组分的成功掺入。
Zeta电位测量（图S1C）显示，Ti₃C₂Tx的表面电位为负值（约−30 mV），经PEI修饰后由于引入大量胺基而转变为正值（约+24 mV）。进一步负载Ru和AuNPs后，Zeta电位降至约+10 mV，表明由静电相互作用和部分电荷中和驱动的成功组装。
进行AFM表征以研究Ti₃C₂Tx纳米片上Au纳米颗粒的表面形态和分散情况。如图S1D所示，Ti₃C₂Tx基底呈现特征性超薄层状结构，而大量对应于AuNPs的明亮突起均匀分布在纳米片表面。纳米颗粒看起来分散良好，无明显聚集，高度对比表明AuNPs的成功负载。AFM图像中观察到的纳米颗粒横向尺寸与TEM测量结果一致（约10–20 nm），证实了AuNPs在Ti₃C₂Tx纳米片上的有效固定。
这种均匀分布…
【数据】Ti₃C₂Tx表面电位：约−30 mV；PEI修饰后：约+24 mV；Ru/AuNPs负载后：约+10 mV；UV-Vis吸收峰：约300 nm、475 nm、525 nm；AuNPs尺寸：约10–20 nm；表征方法：TEM、EDS、UV-Vis、XPS、Zeta电位、AFM
3.3 荧光动力学验证
图2A显示了不同组分省略条件下的荧光动力学。只有含有MMP-2、Bst聚合酶、Cas12a和gRNA的完整系统产生了强烈的荧光增加，而省略任何单一组分（MMP-2、Cas12a、gRNA或Bst聚合酶）或空白样品均导致荧光信号显著降低或无显著变化。
【数据】完整系统组分：MMP-2、Bst聚合酶、Cas12a、gRNA；省略任一组分：荧光信号显著降低或无显著变化
3.4 ECL生物传感器的分析性能
图3A显示了生物传感器在不同MMP-2浓度（0.01 fM至10 nM）下记录的时间分辨ECL响应。图3B显示了相同实验条件下获得的电位依赖性ECL曲线。发射峰出现在约1.2 V附近，对应于PEI-Ti₃C₂Tx/Ru/AuNPs电极上Ru中心的氧化。
【数据】MMP-2浓度范围：0.01 fM至10 nM；ECL发射峰电位：约1.2 V；电极：PEI-Ti₃C₂Tx/Ru/AuNPs
3.5 选择性、稳定性与实际样品分析
该生物传感器对干扰蛋白（凝血酶、IgG、BSA、溶菌酶）表现出高特异性，具有优异的稳定性，在LO2细胞培养上清中获得了满意的回收率（96.9%–105.0%）。
【数据】干扰蛋白：凝血酶、IgG、BSA、溶菌酶；回收率：96.9%–105.0%；实际样品：LO2细胞培养上清
讨论与解读
本研究成功开发了一种高灵敏度和高特异性的ECL生物传感器，用于MMP-2的超灵敏检测。该传感策略通过肽切割、PNA触发的扩增、CRISPR/Cas12a激活和ECL信号读出的顺序多步过程运行，而非一锅反应模式。这种协同机制以卓越的精度将蛋白水解活性转化为放大的ECL信号。在最优条件下，该生物传感器表现出0.01 fM至10 nM的宽线性检测范围和10 aM的超低检测限。在10倍稀释血清和细胞培养上清样品中获得的满意分析性能证明了该生物传感器在复杂生物基质中的适用性，无需大量样品预处理。高导电性Ti₃C₂Tx MXene复合物与Ru基发光体的整合提供了强信号输出和高效电子转移，进一步增强了灵敏度。尽管该传感平台涉及多种功能生物分子和纳米材料，与传统方法如ELISA或荧光测定相比可能增加检测成本，但该策略在分析灵敏度、可编程性和信号放大能力方面具有显著优势。本工作实现的超低检测限对于检测超低丰度生物标志物可能特别有价值。
编译者解读：该研究的方法学亮点在于将蛋白酶活性检测转化为核酸扩增信号，通过HMEA与CRISPR/Cas12a两级放大实现了10 aM级检测限，较传统ELISA灵敏度提升数个数量级。DNA四面体界面设计有效解决了平面固定中探针取向无序的问题。不过，多步操作流程和多种功能生物分子的引入增加了实际应用的复杂度与成本，未来需在集成化与便携化方向进一步优化，方能在临床即时检测场景中发挥潜力。
参考来源
期刊：Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2026
DOI: 10.1016/j.colsurfb.2026.115948
DOI: 10.1016/j.colsurfb.2026.115948