来源：A bisulfite-free sequence-independent biosensor for genomic 5-hydroxymethylcytosine detection via triple-cascade signal amplification（Biosensors and Bioelectronics）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）是一种关键的表观遗传修饰，参与多种生物过程与疾病发生，但其与5-甲基胞嘧啶（5mC）结构高度相似，准确定量始终困难。本研究开发了一种无需亚硫酸氢盐处理、不依赖特定序列的基因组5hmC检测生物传感器，通过将5hmC特异性糖基化磁分离与末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）延伸、滚环扩增（RCA）及DNA酶催化三级级联信号放大相整合，实现了4.41 fM的检测限，可区分5hmC与5mC及未修饰胞嘧啶，并能在单细胞水平分辨不同细胞系的5hmC水平，其人体组织定量结果与金标准ELISA一致。
研究背景
表观遗传学指不改变DNA序列而发生的可遗传基因功能变化，由DNA及染色体相关蛋白的化学修饰介导。5hmC由5mC经TET双加氧酶氧化生成，是主动DNA去甲基化过程的一部分。5hmC不仅在基础生物学过程中发挥重要作用，还深刻影响多种疾病的发生与进展，可作为癌症、神经系统疾病和心血管疾病诊断、治疗及预后的重要生物标志物。因此，精确定量基因组DNA中的5hmC水平，对于研究表观遗传机制如何推动疾病进展以及推进癌症早期检测至关重要。
尽管5hmC在体内丰富，几乎存在于所有哺乳动物组织和细胞中，并呈现组织特异性分布，但其丰度仅为5mC的百分之一至十分之一。5hmC与5mC、5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）之间的结构相似性，加之严重干扰的存在，使得准确检测面临巨大挑战。现有方法多依赖亚硫酸氢盐处理或特异性抗体，前者会造成DNA严重降解，后者存在批次差异和交叉反应性问题。本研究旨在建立一种无亚硫酸氢盐、序列非依赖、无需抗体和DNA降解的5hmC检测平台。
研究方法
1.1 实验方法
有关试剂、寡核苷酸序列（表S1）和实验方案的详细信息见支持信息。
【数据】原文未详述（试剂、序列及方案详见支持信息）
研究结果
2 结果与讨论
#### 2.1 检测原理
基于级联信号放大的荧光生物传感系统用于高灵敏检测人基因组DNA中5-羟甲基胞嘧啶的原理如Scheme 1所示。反应体系由生物素标记的二苯并环辛炔（DBCO）捕获探针、脱嘌呤/脱嘧啶（AP）探针、环状模板和信号探针组成。为防止非特异性扩增，所有AP探针和捕获探针的3′端均修饰了反向dT。该检测包括六个步骤：（1）通过T4噬菌体β-葡萄糖基转移酶（T4 β-GT）将5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）特异性糖基化为N3-葡萄糖基修饰的5hmC（N3-5ghmC）。（2）将生物素化DBCO探针偶联至链霉亲和素修饰的磁珠（MBs）上。（3）N3-5ghmC的叠氮基团与捕获探针的DBCO部分之间发生点击反应，具体为无铜应变促进的炔-叠氮环加成（SPAAC）。该反应由二苯并环辛炔体系的高环张力驱动，完全无需细胞毒性过渡金属铜催化剂，可实现目标DNA高效共价锚定至磁珠表面，随后通过磁分离进行富集。（4）通过末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）以dATP延伸目标DNA的3′-OH末端，生成poly(A)链。（5）poly(A)链与互补AP探针杂交。APE1切割AP位点，产生具有新3′-OH末端的单链DNA（ssDNA）触发子，作为引物启动滚环扩增（RCA），生成含有串联DNA酶序列的长ssDNA产物。（6）RCA扩增的DNA酶表现出依赖二价金属离子辅因子的核糖核酸酶活性，催化信号探针在核糖腺苷（rA）残基处切割。该切割在空间上分离羧基-X-罗丹明（ROX）与Black Hole Quencher 2（BHQ2），恢复ROX荧光。释放的DNA酶可结合额外的信号探针，启动新的催化循环，放大ROX荧光。荧光强度与5hmC水平成正比，从而实现定量分析。
该生物传感器具有三个关键设计要素：（1）T4 β-GT介导的糖基化结合点击化学，实现5hmC的特异性标记和共价捕获，无需抗体和亚硫酸氢盐处理；（2）链霉亲和素-生物素系统将目标固定于磁珠上，通过磁分离有效降低背景干扰；（3）整合TdT辅助延伸、RCA扩增和DNA酶催化，构建三级级联信号放大系统。
【数据】步骤数：6步；探针3′端修饰：反向dT；糖基化酶：T4 β-GT；点击化学类型：SPAAC（无铜）；延伸酶：TdT；底物：dATP；切割酶：APE1；扩增方式：RCA；信号读出：ROX荧光；淬灭基团：BHQ2
#### 2.2 检测体系验证
通过14%天然聚丙烯酰胺凝胶电泳验证检测策略的可行性，如图1A所示。首先，将N3-5ghmC DNA与DBCO修饰的捕获探针孵育后观察到特异性连接条带，证实了基于点击化学的连接反应的有效性（泳道2）。在TdT存在下，可观察到高分子量条带，表明TdT成功介导了poly(A)尾的延伸（泳道3），说明目标识别到信号转导的完成。接下来，经APE1处理poly(A)产物与AP探针形成的双链体后，产生了预期大小的切割产物条带（21 nt），证实AP位点可被APE1精确识别和切割，释放后续扩增所需的引物（泳道4）。此外，在环状模板和DNA聚合酶存在下，可观察到RCA产物条带（泳道5）；当信号探针存在时，可观察到信号探针的切割条带（泳道6），验证了RCA被释放的引物有效触发并产生了具有催化活性的DNA酶。综上，通过各步骤预期的电泳特征，系统证明了级联放大检测的逻辑合理性和实验可行性。
为进一步验证检测可行性，进行了荧光光谱分析（图1B）。在缺乏5hmC-DNA的对照组中（灰线），608 nm发射波长处未检测到显著荧光信号。相反，含5hmC-DNA的实验组（红线）检测到强荧光信号。以信噪比（F/F0）表征检测性能，含5hmC DNA时的荧光强度为不含时的10.03倍，表明仅5hmC-DNA在反应体系中产生特征性荧光信号。对裸磁珠（MBs）和DNA偶联磁珠（DNA-MBs）在超纯水（pH = 7.00，25°C）中进行Zeta电位分析。如图1C所示，MBs的Zeta电位为+2.81 mV，DNA-MBs显著降至−43.26 mV。这一显著负移证实了带负电荷的DNA分子偶联至磁珠，目标5hmC DNA可被成功富集。
【数据】凝胶浓度：14%天然聚丙烯酰胺；切割产物大小：21 nt；荧光发射波长：608 nm；信噪比（F/F0）：10.03；Zeta电位（MBs）：+2.81 mV；Zeta电位（DNA-MBs）：−43.26 mV；Zeta电位测定条件：超纯水，pH 7.00，25°C
#### 2.3 检测灵敏度
在优化实验条件下（图S1），测量了不同浓度5hmC-DNA诱导的荧光强度。结果显示，荧光强度随5hmC-DNA浓度增加而显著增强（图2A）。荧光强度（F）与5hmC-DNA浓度对数（lg c）在10⁻⁵ nM至10 nM范围内呈线性关系（图2B），回归方程为：F = 1990 + 324.3 lg c，相关系数（R²）为0.9951，检测限（LOD）为4.41 fM，性能优于现有5hmC-DNA分析方法（表S2）。
【数据】线性范围：10⁻⁵ nM至10 nM；回归方程：F = 1990 + 324.3 lg c；R²：0.9951；LOD：4.41 fM
#### 2.4 特异性分析
进一步采用九种单链寡核苷酸——包括含5hmC位点的ssDNA（a-5hmC和a'-5hmC）、含5mC位点的ssDNA（a-mC和a'-mC）以及未修饰胞嘧啶序列（a-C和a'-C）——两两退火形成九种不同的dsDNA双链体，用于生物传感器的特异性评估。如图3A所示，缺乏5hmC位点的dsDNA产生的荧光信号强度极低。相反，含5hmC位点的dsDNA诱导显著增强的荧光信号，强度约为无5hmC dsDNA对照平均信号的12.3倍。为进一步评估所提出生物传感器的定量准确性和可靠性，研究了实际输入5hmC浓度与测量值之间的相关性。如图3B所示，测量的5hmC水平（Y）与理论输入浓度（c）表现出极好的一致性，回归方程为Y = 0.01772 + 0.9985 lg c（R² = 0.9998），斜率非常接近1。这些结果有力证实了所开发方法对5hmC定量检测具有高准确性和可靠性。
【数据】测试dsDNA双链体数量：9种；含5hmC dsDNA信号倍数：约12.3倍（相对于无5hmC对照平均值）；回归方程：Y = 0.01772 + 0.9985 lg c；R²：0.9998；斜率：0.9985
#### 2.5 细胞中5hmC检测
为验证所构建生物传感器在细胞全基因组5hmC分析中的适用性，我们将其用于测量一组细胞系中的5hmC水平（图4A）。测试样本包括一种非癌细胞系（人胚肾HEK293）和四种癌细胞系：人肺腺癌A549、人乳腺癌MCF-7、人神经母细胞瘤SK-N-BE(2)和人宫颈癌HeLa（图4B）。需要指出的是，先前研究已证明5hmC丰度存在组织特异性差异。与正常组织相比，5hmC水平在神经和脑组织中通常较高，而在多种恶性肿瘤中显著降低。我们使用所提出的生物传感器检测了基因组……
【数据】测试细胞系：5种（HEK293、A549、MCF-7、SK-N-BE(2)、HeLa）；细胞系类型：1种非癌（HEK293）+ 4种癌（A549、MCF-7、SK-N-BE(2)、HeLa）；原文未详述具体5hmC定量数值
#### 2.6 组织样本中5hmC检测
（原文该部分内容未完整提供，以下为基于图5图注的客观描述）
图5展示了利用该生物传感器检测多种组织中5hmC水平的示意图（图5A）。图5B显示了A-A0值与标准5hmC-DNA浓度之间的线性相关回归曲线，插图为不同5hmC-DNA浓度对应反应产物的彩色照片。图5C展示了……
【数据】原文未详述
讨论与解读
3 结论
总之，我们开发了一种通过三级级联信号放大实现基因组5-羟甲基胞嘧啶检测的无亚硫酸氢盐、序列非依赖性生物传感器。核心创新在于将5hmC特异性糖基化介导的磁分离与级联信号放大系统（即TdT辅助延伸、RCA和DNA酶催化）协同整合。该设计消除了对特定抗体和亚硫酸氢盐处理的依赖，从而有效避免了严重的DNA降解。该生物传感器具有高灵敏度，检测限为4.41 fM，特异性良好，可区分5hmC与5mC及C。此外，该生物传感器能以单细胞灵敏度有效区分不同细胞系间的5hmC水平，并能准确定量多种人体组织中的5hmC丰度。重要的是，该生物传感器获得的结果与商业ELISA试剂盒一致。本研究为多种生物样本中低丰度表观遗传修饰的精确定量提供了强大平台，在临床诊断和生物医学研究中具有广阔应用前景。
编译者解读
该研究的方法学价值在于用点击化学的共价捕获替代了抗体识别，从根本上规避了抗体批次差异和亚硫酸氢盐降解两大痛点。三级级联放大（TdT延伸→RCA→DNA酶催化）的设计思路巧妙，每一级都兼具信号放大与背景降低功能。不过，SPAAC点击化学依赖DBCO-叠氮反应，而T4 β-GT对5hmC的糖基化效率是否在不同序列背景下保持一致，是决定该方法序列非依赖性的关键前提。此外，DNA酶催化的金属离子依赖性可能对复杂生物样本（如组织裂解液）中的螯合环境敏感，实际临床转化时需进一步验证基质效应。
参考来源
期刊：Biosensors and Bioelectronics, 2026
DOI：10.1016/j.bios.2026.118931
DOI: 10.1016/j.bios.2026.118931