来源：Amplified fluorescent biosensor via Clostridium butyricum argonaute and CRISPR/Cas12a-powered synergistic sensing strategy for DNA amplification-free detection of foodborne Salmonella（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
食源性致病菌的灵敏检测是食品安全的关键防线。本研究提出了一种丁酸梭菌Argonaute（CbAgo）与CRISPR/Cas12a协同放大的传感策略，构建了免DNA扩增荧光（ACF）生物传感器，用于鼠伤寒沙门氏菌的超灵敏检测。该传感器利用磁珠-噬菌体偶联物选择性捕获活菌，5分钟内完成DNA提取，通过CbAgo切割产物tDNA桥接激活Cas12a的反式切割活性，实现指数级信号放大。在优化条件下，检测限达24.8 CFU/mL，线性范围10²–10⁷ CFU/mL，无需DNA扩增步骤，并在20份实际食品样品中取得了与qPCR相当的检测性能。
研究背景
食源性致病菌暴发是最严重的公共卫生危机之一，每年造成巨大的社会经济负担。以沙门氏菌为例，全球每年约1500万人感染侵袭性沙门氏菌病，近20万人因此死亡。美国每年与沙门氏菌相关的经济损失达41亿美元，欧盟成员国合计约30亿欧元。饮食摄入是沙门氏菌感染的主要传播途径——该病原体广泛污染鸡肉、鸡蛋等多种食品，并渗透于食品加工、储存和分销的全链条。现代食品供应链的固有复杂性与消费者对生鲜或即食食品偏好的增加，进一步加剧了这些风险。因此，在食品基质中灵敏、准确、快速地检测沙门氏菌，是防止食源性疾病传播、保障公共卫生和减少经济损失的关键途径。当前沙门氏菌检测方法主要包括标准培养法、免疫分析和基于PCR的分子技术。标准培养法是金标准，准确性高、操作成本低，但耗时较长。因此亟需开发无需DNA扩增、快速灵敏的新型检测策略。
研究方法
2.1 材料与仪器
羧基功能化磁珠（MBs，1000 nm，10 mg/mL）购自Invitrogen，Thermo Fisher Scientific（美国）。丁酸梭菌Argonaute（CbAgo）由本实验室表达纯化[27]。Engen® Lba Cas12a（100 μM）购自New England Biolabs（美国）。牛血清白蛋白、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、2-[N-吗啉代]乙磺酸、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司（中国）。所有DNA和RNA由生工生物工程（上海）股份有限公司（中国）制备，序列列于支持信息（表S1）。鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 14028）、单增李斯特菌（ATCC 19115）、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）和大肠杆菌（ATCC 43888）购自美国典型培养物保藏中心（Manassas，Virginia，美国）。磁力分离器购自上海碧云天生物技术有限公司（中国）。多功能酶标仪（Bio-Tek，Synergy H4）用于检测荧光信号。凝胶成像仪（Bio-Rad，Gel Doc XR+）用于凝胶成像。Nano ZS（Malvern Instruments Ltd.，英国）用于分析zeta电位。场发射扫描电子显微镜（TESCAN MIRA4，捷克）用于表征MBs-噬菌体偶联物。
【数据】磁珠规格：1000 nm，10 mg/mL；Cas12a浓度：100 μM；菌株：S. typhimurium ATCC 14028、L. monocytogenes ATCC 19115、S. aureus ATCC 29213、E. coli ATCC 43888；仪器：Synergy H4酶标仪、Gel Doc XR+凝胶成像仪、Nano ZS、TESCAN MIRA4 SEM
2.2 MBs-噬菌体偶联物的制备
MBs-噬菌体偶联物的制备参照我们前期工作[34]。简要而言，1 mg MBs经磁力分离器洗涤后，重悬于500 μL 2-[N-吗啉代]乙磺酸缓冲液（pH = 6.0，10 mM）中。将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（10 mg/mL，20 μL）和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠（5 mg/mL，20 μL）与MBs溶液混合。混合物在37 °C下温和搅拌15 min。经磁力分离后重悬于500 μL磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.4，10 mM）中，加入噬菌体LPST10（10⁹ PFU/mL，100 μL），在37 °C、100 rpm/min条件下振荡3 h。反应完成后，进行磁力分离步骤以去除未反应的噬菌体，加入500 μL牛血清白蛋白溶液（m/v，3%），在37 °C下反应30 min以封闭未结合位点。最后，MBs-噬菌体偶联物用PBST溶液（含0.5% Tween 20的10 mM PBS，pH = 7.4）洗涤三次，随后用PBS溶液重悬至终浓度1 mg/mL。所得MBs-噬菌体偶联物于4 °C保存用于后续实验。
【数据】MBs用量：1 mg；MES缓冲液：pH 6.0，10 mM，500 μL；EDC：10 mg/mL，20 μL；NHS：5 mg/mL，20 μL；第一次反应：37°C，15 min；PBS：pH 7.4，10 mM，500 μL；噬菌体LPST10：10⁹ PFU/mL，100 μL；第二次反应：37°C，100 rpm/min，3 h；BSA封闭：3%（m/v），500 μL，37°C，30 min；洗涤：PBST（0.5% Tween 20），3次；终浓度：1 mg/mL；保存：4°C
2.3 MBs-噬菌体介导的鼠伤寒沙门氏菌捕获与基因组DNA分离
MBs-噬菌体偶联物用于识别和捕获溶液或实际样品中的鼠伤寒沙门氏菌。将200 μL MBs-噬菌体偶联物（0.2 mg/mL）加入400 μL样品溶液中，混合溶液在37 °C下温和振荡15 min。上清液用于计算捕获效率。捕获效率计算公式如下：{[初始沙门氏菌浓度 - 残余沙门氏菌浓度] / 初始沙门氏菌浓度} × 100%。经磁力分离并洗涤两次后，向MBs-噬菌体-鼠伤寒沙门氏菌复合物（分散于200 μL无菌无DNase/RNase水中）中加入25 μL放射免疫沉淀分析裂解缓冲液，随后在37 °C下孵育5 min。磁力分离1 min后，收集上清液。鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA于−20 °C保存用于后续实验。
【数据】MBs-噬菌体偶联物：0.2 mg/mL，200 μL；样品体积：400 μL；捕获条件：37°C，15 min；裂解缓冲液：RIPA，25 μL；裂解条件：37°C，5 min；磁力分离：1 min；保存温度：−20°C
2.4 用于检测鼠伤寒沙门氏菌的ACF生物传感器
将gDNA1（2 μM，2 μL）、gDNA2（2 μM，2 μL）、gDNA3（2 μM，2 μL）与2 μL CbAgo溶液（400 μg/mL）在无菌无DNase/RNase微量离心管中混合。混合溶液在37 °C下孵育15 min。向混合物中加入MnCl₂（5 mM，1 μL）、Tris-HCl（20 mM，3 μL）和H₂O（3 μL）。随后，加入5 μL系列稀释的鼠伤寒沙门氏菌DNA，使总反应体积达到20 μL。反应在37 °C下进行1 h。将Cas12a（0.75 μM，2 μL）、crRNA（1.2 μM，2 μL）和10 × NEB缓冲液（3 μL）充分混合，在37 °C下孵育15 min以形成预组装复合物。将预组装的Cas12a溶液与CbAgo反应混合物、FAM-ssDNA-BHQ-2荧光探针（10 μM，2 μL）和H₂O（1 μL）混合。最终30 μL反应体系在37 °C下孵育1.5 h。将反应溶液转移至384孔微板中，使用多功能酶标仪测量。荧光信号变化计算为ΔFL（a.u.）= F(样品) – F(空白)。
【数据】gDNA1/2/3：各2 μM，2 μL；CbAgo：400 μg/mL，2 μL；第一次孵育：37°C，15 min；MnCl₂：5 mM，1 μL；Tris-HCl：20 mM，3 μL；H₂O：3 μL；样品DNA：5 μL；总反应体积：20 μL；切割反应：37°C，1 h；Cas12a：0.75 μM，2 μL；crRNA：1.2 μM，2 μL；10×NEB缓冲液：3 μL；Cas12a预组装：37°C，15 min；荧光探针：FAM-ssDNA-BHQ-2，10 μM，2 μL；H₂O：1 μL；最终体积：30 μL；最终反应：37°C，1.5 h；检测：384孔板，多功能酶标仪
2.5 实际样品检测
使用从当地市场购买的牛奶样品进行回收实验，经标准平板计数法验证不含活菌。牛奶样品中掺入不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌培养物，使最终污染水平分别达到10³、10⁴和10⁵ CFU/mL。用PBS溶液（pH = 7.4，10 mM）5倍稀释后，掺入样品用MBs-噬菌体偶联物富集，然后由所开发的ACF生物传感器检测。从不同当地市场共获取20份食品样品（10份鸡肉和10份猪肉）。在无菌条件下称取每份25 g样品至含225 mL PBS溶液（pH = 7.4，10 mM）的过滤均质袋中。室温下均质5 min。静置10 min后，收集上清液，分别用基于MBs-噬菌体的ACF生物传感器和定量实时PCR（qPCR）检测。每个样品设三个平行。
【数据】牛奶样品掺入浓度：10³、10⁴、10⁵ CFU/mL；稀释倍数：5倍；PBS：pH 7.4，10 mM；食品样品：20份（10份鸡肉+10份猪肉）；样品量：25 g；PBS体积：225 mL；均质：室温，5 min；静置：10 min；平行数：3
研究结果
3.1 基于CbAgo和CRISPR/Cas12a的协同传感策略原理
实现高效信号放大仍然是生物传感技术的关键挑战。本研究提出了一种协同放大策略，利用CbAgo蛋白和Cas12a蛋白，进一步构建为高灵敏度荧光生物传感器，用于免DNA扩增检测鼠伤寒沙门氏菌。这一创新设计利用了CbAgo的精确切割能力和Cas12a的ssDNA触发激活特性。操作机制如方案1所示。基于CbAgo和CRISPR/Cas12a的协同传感策略主要由两个集成系统组成：CbAgo介导的tDNA生成系统和tDNA激活的CRISPR/Cas12a反式切割系统。其中tDNA是CbAgo蛋白对鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA的主要切割产物。作为关键功能桥梁，tDNA实现了这两个系统之间的无缝耦合。在gDNA引导下，CbAgo蛋白识别鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA并切割双链DNA碱基内的磷酸二酯键，释放tDNA片段。这种初级切割发生在互补DNA链上gDNA结合位点下游第10至第11个碱基位置。随后，引入CRISPR/Cas12a系统替代传统的CbAgo介导的次级荧光探针切割，从而在两种基因编辑酶之间建立直接的酶促交接。CRISPR/Cas12a能够进一步切割荧光探针（FAM-ssDNA-BHQ），基于荧光共振能量转移实现高效荧光信号读出。得益于CbAgo系统的精确切割特异性和CRISPR/Cas12a系统的强大反式切割活性，该协同传感策略有望实现指数级信号放大，同时规避传统靶向dsDNA的CRISPR/Cas12a系统固有的PAM序列限制。
【数据】切割位点：gDNA结合位点下游第10-11个碱基；荧光探针：FAM-ssDNA-BHQ；原文未详述其他具体数值
#### 3.1.1 验证CbAgo对鼠伤寒沙门氏菌基因组的切割
为评估所提出协同传感策略的可行性，我们首先使用传统CbAgo传感系统验证了CbAgo蛋白对鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA的切割活性。设计并合成了三条gDNA序列（gDNA1、gDNA2、gDNA3）、一条对应鼠伤寒沙门氏菌基因组序列的dsDNA片段（由ssDNA1和ssDNA2组成）以及荧光探针（FAM-ssDNA-BHQ1）。在gDNA引导下，CbAgo蛋白对靶dsDNA进行精确初级切割。产生的tDNA片段结合游离CbAgo蛋白，执行对荧光探针的次级切割（图1A）。如图1B所示，阴性对照（无dsDNA）表现出低基线荧光，随时间信号漂移极小。阳性样品表现出渐进增强的荧光强度，验证了CbAgo对鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA片段的切割。此外，与任何单一gDNA相比，三条gDNA的组合显著改善了下游荧光信号（图S1），表明多重gRNA靶向增强了CbAgo系统的切割效率。我们通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进一步验证了CbAgo的精确切割能力。与gDNA（gDNA1和gDNA2）杂交后，CbAgo蛋白在特定位点切割复合物，产生下游反应所需的tDNA（图1C）。如图1D所示，泳道1仅含gDNA，泳道2显示ssDNA1。泳道3显示gDNA-ssDNA1杂交复合物，与泳道2相比分子量和条带强度增加，确认杂交成功。在泳道4（CbAgo介导的切割）中，上条带与泳道3相应位置相比强度显著降低，表明ssDNA1被位点特异性切割。同时，泳道4中增强的下条带确认了tDNA的生成。生成的tDNA身份得到CbAgo成熟切割机制的有力支持，该机制精确切割靶链相对于gDNA 5′端第10和第11个核苷酸之间的位置[27,35]。这些结果明确证明了CbAgo蛋白对鼠伤寒沙门氏菌基因组靶标的精确切割活性。
【数据】gDNA浓度：2 μM；CbAgo浓度：400 μg/mL；切割位点：相对于gDNA 5′端第10-11个核苷酸之间；阴性对照荧光：低基线；原文未详述其他具体数值
#### 3.1.2 双链和单链DNA激活CRISPR/Cas12a系统的活性比较
先前研究已报道，ssDNA激活CRISPR/Cas12a系统的效率高于dsDNA，同时消除了PAM序列限制[20,36]。鉴于我们的CbAgo-Cas12a系统采用ssDNA片段（tDNA）进行激活，我们通过实验验证了这种ssDNA激活的优越性。我们合成了dsDNA（由ssDNA1和ssDNA2杂交）和tDNA，然后通过实时荧光监测比较评估它们的Cas12a激活能力（图2A）。如图2B所示，tDNA触发的Cas12a反式切割活性显著强于dsDNA，更早达到平台期，同时消除了PAM序列限制。这种PAM非依赖的高效tDNA-Cas12a激活特性使其非常适合我们的双酶协同策略。
【数据】激活剂：tDNA vs dsDNA；tDNA激活Cas12a反式切割活性：显著强于dsDNA；平台期：tDNA更早达到；PAM限制：消除；原文未详述具体荧光数值
#### 3.1.3 CbAgo-Cas12a协同切割系统的可行性
基于上述验证研究，我们将CbAgo介导的tDNA生成模块与tDNA激活的Cas12a反式切割模块结合，构建了CbAgo-Cas12a协同切割系统。使用相同浓度的鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA作为靶标，我们对CbAgo-Cas12a协同系统与仅Cas12a切割进行了比较评估，以展示其动力学和灵敏度优势（图2C）。基于荧光监测的动力学分析揭示了两种方式之间的显著差异。CbAgo-Cas12a协同切割系统表现出快速荧光增强，而单独Cas12a显示信号积累缓慢（图2D）。CbAgo切割产物成功激活下游Cas12a系统，提供了功能性证据，表明tDNA具有Cas12a识别和反式切割所需的正确序列。这种显著的动力学优势证明了双酶系统优越的传感效率和增强的检测潜力。
【数据】靶标：鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA（相同浓度）；协同系统：快速荧光增强；单独Cas12a：信号积累缓慢；原文未详述具体荧光数值
3.2 MBs-噬菌体介导的鼠伤寒沙门氏菌捕获表征
噬菌体已进化为强健的病原体特异性识别元件，用于增强生物传感器的分析性能。为实现高效的鼠伤寒沙门氏菌富集，我们通过将鼠伤寒沙门氏菌特异性噬菌体共价固定在羧基功能化MBs上，制备了MBs-噬菌体偶联物（图3A）。噬菌体偶联后，MBs-噬菌体偶联物的zeta电位从−38.5 mV变为−31.9 mV（图3B）。基于扫描电子显微镜（SEM）的形态学表征显示，MBs-噬菌体偶联物呈均匀球形（图3C），鼠伤寒沙门氏菌细胞呈杆状（图3D）。捕获过程后，SEM图像清晰展示了MBs-噬菌体偶联物与靶标鼠伤寒沙门氏菌细胞之间的结合（图3E）。随后，结合标准平板计数法测定了MBs-噬菌体偶联物对鼠伤寒沙门氏菌的捕获效率。结果显示，MBs-噬菌体在15 min内实现了80.8%的鼠伤寒沙门氏菌捕获效率（图3F），与先前报道的基于噬菌体的磁性富集技术相当[34,37,38]，确立了MBs-噬菌体偶联物作为高性能细菌富集元件的地位。
【数据】zeta电位：MBs-噬菌体偶联物从−38.5 mV变为−31.9 mV；捕获效率：80.8%；捕获时间：15 min；形态：MBs-噬菌体均匀球形，沙门氏菌杆状
3.3 ACF生物传感器的构建
在上述基础研究之上，我们通过策略性整合CbAgo和Cas12a系统，开发了用于鼠伤寒沙门氏菌检测的ACF生物传感器。CbAgo介导的鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA切割产生tDNA，这些tDNA作为关键分子桥梁，将CbAgo的精确切割能力与Cas12a的高效反式切割活性协同整合，实现指数级信号放大。在优化条件下，ACF生物传感器对鼠伤寒沙门氏菌表现出10²–10⁷ CFU/mL的线性检测范围和24.8 CFU/mL的检测限，无需DNA扩增步骤。此外，ACF生物传感器展示了与qPCR assay相当的分析性能，并在20份食品样品的鼠伤寒沙门氏菌检测中取得了满意结果，凸显了其作为食源性病原体监测超灵敏工具的潜力。
【数据】线性检测范围：10²–10⁷ CFU/mL；检测限：24.8 CFU/mL；食品样品：20份；无需DNA扩增
讨论与解读
本研究报道了一种基于CbAgo-CRISPR/Cas12a驱动的ACF生物传感器，用于鼠伤寒沙门氏菌检测。MBs-噬菌体偶联物选择性富集活的鼠伤寒沙门氏菌以确保高准确性。双酶协同策略整合了CbAgo的精确切割能力与Cas12a的强大反式切割活性，实现了指数级信号放大和超高传感效率。所开发的ACF生物传感器对鼠伤寒沙门氏菌表现出超灵敏性，消除了DNA扩增的需求，克服了传统核酸检测方法的局限性，同时对复杂基质中的多种病原体展现出广泛适用性。未来工作将聚焦于整合微流控和机器学习，开发智能自动化生物传感平台用于现场生化分析。
编译者解读：该研究的方法学亮点在于用CbAgo的切割产物tDNA作为"分子桥梁"连接两个基因编辑酶系统——这一设计巧妙规避了Cas12a对PAM序列的依赖，同时保留了其高效反式切割的放大能力。80.8%的噬菌体捕获效率和24.8 CFU/mL的检测限在免扩增体系中表现突出。不过，CbAgo蛋白需实验室自行表达纯化，其批间一致性和长期稳定性是实际推广的关键瓶颈。此外，噬菌体对宿主菌的高度特异性虽保证了准确性，却也意味着每换一种靶标菌就需要重新筛选噬菌体，这在一定程度上限制了该平台的通用性。若能与微流控集成实现自动化，该策略在食安现场快检领域有较大转化潜力。
参考来源
期刊：Chemical Engineering Journal, 2026
DOI：10.1016/j.cej.2026.177690
DOI: 10.1016/j.cej.2026.177690