来源：Cascade amplified photoelectrical-chemiluminescence dual-mode biosensor for ultrasensitive HIV-1 p24 detection（Microchemical Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
HIV急性感染期病毒载量极高但血清学标志物尚不可测，p24抗原是最早可检出的诊断标志物之一。现有方法依赖大型仪器、灵敏度不足或抗干扰能力弱。本研究构建了一种光电-化学发光（PE-CL）双模式生物传感器，利用AuSi纳米结等离激元增强热电子发射实现PE检测，同时借助金纳米颗粒辅助的杂交链式反应（HCR）级联放大系统协同增强两种信号输出。PE模式检出限为5.58 pg/mL，CL模式为2.27 pg/mL，血清加标回收率为94.0%–106.1%。
研究背景
HIV感染仍是全球公共卫生难题，及时准确的诊断对阻断传播、改善临床结局至关重要。急性感染期（暴露后最初2–3周）病毒复制急剧上升，病毒血症水平极高，但血清学标志物基本检测不到。HIV-1衣壳蛋白p24是最早可检出的诊断生物标志物之一，通常在感染后10–14天、抗体血清转换之前即可检测到。相比抗体检测，p24的早期出现使其能显著缩短诊断窗口期——急性感染者传染性极强却呈血清阴性，因此超灵敏p24检测对减少此传播高发期的漏诊尤为关键。
目前已建立的HIV诊断方法包括PCR、ELISA、荧光免疫分析、侧向层析快速检测、化学发光、局域表面等离激元共振（LSPR）和表面增强拉曼光谱（SERS）等。这些方法在检测速度或可及性方面各有优势，但普遍存在成本高、抗干扰能力差或灵敏度不足的问题。多数方法依赖单一模式检测，难以兼顾高灵敏度、强抗干扰与可靠性。
研究方法
双模式生物传感器装置的设计、制备与实验搭建
首先使用Nikon NSR i-line步进光刻机在10 cm n-Si晶圆（电阻率1–10 Ωcm）上，将纳米光栅图案化于500 nm厚的光刻胶层（Shipley 1805）中。图案通过干法刻蚀工艺转移至硅衬底，具体使用反应离子刻蚀（RIE）系统（Tegal 903e）。在光栅区域之外，沉积10 nm Al₂O₃和200 nm SiO₂双层膜作为后续电极沉积的绝缘层。随后，通过磁控溅射在光栅区域沉积1 nm Ti和50 nm Au的叠层。最后，分别在传感区域周围和芯片背面制备环形电极和背面电极（15 nm Ti / 100 nm Al / 15 nm Ti / 100 nm Au）。完成后的器件与聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控通道键合。该微流控装置可促进传感表面的快速稳定灌注，确保整个传感区域被引入的液体有效覆盖。
【数据】光刻胶厚度：500 nm；晶圆：10 cm n-Si，电阻率1–10 Ωcm；绝缘层：10 nm Al₂O₃ / 200 nm SiO₂；金属沉积：1 nm Ti / 50 nm Au；背面电极：15 nm Ti / 100 nm Al / 15 nm Ti / 100 nm Au；刻蚀系统：Tegal 903e RIE
AuNPs的合成与修饰
AuNPs采用改良Turkevich法合成。Ab2-AuNPs-S偶联物在先前报道方案的基础上稍作优化制备。HRP-AuNPs-H1和HRP-AuNPs-H2则在已报道方法基础上进行部分修改后制备。所有详细实验步骤见支持信息。
【数据】AuNPs合成方法：改良Turkevich法；详细步骤：见支持信息
HCR信号放大系统的设计
HCR被用作微流控芯片上p24检测的信号放大策略。它是在室温无酶环境下由引发链启动的一系列级联杂交反应。HCR系统所用序列见表S1（支持信息）。通过天然PAGE进一步验证了S、H1和H2之间的HCR信号放大性能。详细HCR信号放大步骤见支持信息。为验证S链与发夹探针H1、H2分别修饰到AuNPs后HCR反应是否仍能正常发生，通过动态光散射对相关反应物和HCR产物进行了测量。
【数据】反应条件：室温、无酶环境；序列信息：表S1；HCR验证方法：天然PAGE、动态光散射
在PE-CL双模式生物传感器上检测p24
在微流控器件上开发了HCR增强的原位PE-CL双模式检测策略，用于p24的高灵敏准确检测。首先，将10 μg L⁻¹ Ab1注入蛋白A修饰的通道中，4 °C孵育1 h，随后用5 wt% BSA封闭1 h。然后将目标p24注入通道，被固定的Ab1捕获。之后加入制备好的Ab2-AuNPs-S溶液，室温孵育1 h。随后，将两种HRP修饰的AuNPs（HRP-AuNPs-H1和HRP-AuNPs-H2）分别在管中热退火形成发夹结构，然后引入微流控通道，触发由Ab2-AuNPs-S表面触发链S启动的HCR信号放大反应。最后，用PBS彻底冲洗未结合的材料。整个分析流程总检测时间约需4 h，主要耗时于抗体-抗原结合和HCR扩增所需的最佳孵育步骤，但最终双模式信号读出过程非常高效。对于PE检测，自制的基于SPR的PE检测装置通过直接探测光信号产生电信号，间接反映引起光信号变化的生化反应。对于CL检测，将鲁米诺和过氧化氢的混合物以10 μL min⁻¹的优化流速注入通道。选择该流速是为了确保底物的连续稳定供应，同时防止反应物局部耗竭，从而最大化稳态CL发射。相反，在早期的抗原/抗体结合步骤中，采用静态孵育而非动态流动，以提供足够时间使高亲和力特异性相互作用达到平衡，同时避免过度消耗贵重试剂。注入的底物被固定在通道表面的AuNPs上的HRP催化，产生CL信号。CL信号在5 min内使用超微弱化学发光分析仪（BPCL-2-TGC，广州微光科技有限公司）记录。
【数据】Ab1浓度：10 μg L⁻¹；孵育温度/时间：4 °C / 1 h；封闭液：5 wt% BSA，1 h；Ab2-AuNPs-S孵育：室温1 h；CL底物流速：10 μL min⁻¹；CL记录时间：5 min；总检测时间：约4 h；CL仪器：BPCL-2-TGC
芯片上选择性及实际样品分析
为评估HCR增强双模式微流控PE-CL生物传感器的特异性，采用0.1 ng/mL p24标准溶液作为目标分析物。选取四种潜在干扰物：HIV-1包膜糖蛋白gp120、人血清转铁蛋白（TRF）、凝血酶和人免疫球蛋白G（IgG）。每种干扰蛋白配制浓度为100 ng/mL（为目标浓度的1000倍），以模拟实际检测中可能的基质干扰。通过比较生物传感器对目标p24和干扰物质的信号响应（SPR诱导的电变化和CL发光强度）来量化选择性。对于实际样品分析，人血清样品来自健康志愿者（经深圳市第二人民医院伦理委员会批准）。血清样品中加标不同浓度的p24，最终浓度分别为0.05、0.5和5 ng/mL。每个加标样品用所建立的PE-CL双模式生物传感器检测三次。
【数据】目标物浓度：0.1 ng/mL p24；干扰物浓度：100 ng/mL（gp120、TRF、凝血酶、IgG）；加标浓度：0.05、0.5、5 ng/mL；检测重复：三次
研究结果
PE-CL双模式生物传感器示意图及工作原理
本研究开发了一种通过同时增强SPR响应和CL信号的级联信号放大双模式生物传感方法（图1）。如图1A所示，传感器由薄金膜包覆的硅光栅组成，通过步进光刻实现晶圆级制备。光栅参数设定如下：周期（P）= 900 nm，宽度（W）= 600 nm，高度（h）= 28 nm，Au膜厚度（H）= 50 nm。聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控通道集成于顶面，两个电极分别连接金膜和硅衬底。金膜既作为生物传感界面，也作为AuSi肖特基二极管的电极。制备的器件（支持信息图S1）安装在印刷电路板上，通过引线键合实现电互连。具体而言，这种AuSi光栅结构能够实现高品质因子（Q因子）的SPR，局域电磁场限制在金膜表面，在优化配置下表现出窄带吸收和透射。这一独特的光学特性与生物分子表面结合及高灵敏PE-CL生物传感的需求完美契合。检测流程包括三个步骤：第一，将葡萄球菌蛋白A（SpA）固定在微流控通道表面，确保抗体正确取向（I，图1B）。第二，通过免疫反应将p24抗原修饰到通道表面（II，图1B）。第三，依次引入Ab2-AuNP-S、HRP-AuNP-H1和HRP-AuNP-H2。其中Ab2-AuNP-S与p24结合形成三明治复合物，随后由HRP-AuNP-H1和HRP-AuNP-H2触发HCR，导致大量AuNPs和HRP分子固定在通道表面（III，图1C）。随着表面修饰的进行，Au表面的折射率逐渐增大，导致共振波长红移。当器件在短于其共振波长的固定波长下照射时，该波长的光吸收在状态I、II和III中依次降低。由于在同一AuSi结中三个状态的热电子产生率和发射概率几乎相同，PE光电流与Au膜吸收成正比（图S2；模拟细节见支持信息）。对于CL检测，将鲁米诺和H₂O₂的混合物引入通道，CL信号由固定的AuNPs和HRP的催化作用产生，同时使用超微弱发光分析仪监测（图1C）。
【数据】光栅周期：900 nm；宽度：600 nm；高度：28 nm；Au膜厚度：50 nm；检测步骤：3步
PE生物传感器性能评估
PE传感机制依赖于AuSi肖特基纳米结中热电子发射的调制。在光子能量超过肖特基势垒高度的光照下，金膜中的光吸收产生热电子，能够克服势垒注入硅衬底，形成可测量的光电流。SPR对局部折射率变化的高灵敏度使金膜上的生物分子结合能够在共振波长附近引起显著的光吸收变化，直接转化为可区分的电流信号。高性能PE传感需要高品质因子SPR、强局域电磁场和高效光吸收。通过光栅高度优化精确平衡辐射损耗和吸收损耗，可实现线宽小于5 nm的共振完美吸收。如图2所示，模拟和实验吸收光谱均在1500 nm处显示明显峰值，实测半高全宽（FWHM）为2.71 nm（图2A），显著窄于大多数已报道的SPR传感器。PE响应度光谱在同一波长处达到峰值，FWHM为3.11 nm（图2B），证实SPR增强热电子发射是PE转换的核心机制。对于强度 interrogation模式，折射率差为0.0074的两种溶液之间的光吸收变化达到40%（图2C）。相应的实时电学监测结果（图2D）显示，在12 mW光照下光电流差为66 nA。在基线噪声水平为0.12 nA的情况下，PE传感的检出限（LOD）计算约为1.3 × 10⁻⁵ RIU。光电流随光照功率增加而增大（图2E），表明可通过增强激发功率进一步降低LOD。为验证生物分子检测适用性，在成熟的多步方案下测试了HIV-1 p24抗原。分析前，通过CL信号评估了Ab1在器件表面的修饰。如支持信息图S3所示，当p24抗体成功修饰到器件表面时产生了明显的CL信号强度。图2F显示了在2 mW光照下注入50 ng·mL⁻¹ p24后的实时光电流响应。信号轨迹清晰呈现三个特征阶段：稳定的初始基线、特异性抗体-抗原结合过程中的实时信号波动、以及PBS洗涤后的信号稳定。最终平台（状态II，图1B）与初始状态（状态I，图1B）之间的17 nA电流差为超灵敏痕量生物分子检测奠定了坚实基础。
【数据】吸收峰波长：1500 nm；FWHM（吸收）：2.71 nm；FWHM（PE响应度）：3.11 nm；折射率差：0.0074；吸收变化：40%；光电流差：66 nA（12 mW）；基线噪声：0.12 nA；PE LOD：1.3 × 10⁻⁵ RIU；p24浓度：50 ng·mL⁻¹；光照功率：2 mW；电流差：17 nA
AuNPs的功能化与表征
AuNPs进一步提供了大比表面积、优异的光学和电化学性能以及稳健的生物偶联能力，使其成为信号增强的理想选择。合成了三种功能化AuNPs复合物（Ab2-AuNPs-S、HRP-AuNPs-H1、HRP-AuNPs-H2），以实现蛋白质到核酸的信号转换和HCR启动，从而实现级联信号放大。采用冷冻法实现AuNPs与HRP和DNA链的同时功能化。HRP用量优化（支持信息图S4）确定AuNP与HRP体积比100:3（100 μL AuNP悬浮液:3 μL 10 mg·mL⁻¹ HRP）为胶体稳定性的最佳条件。透射电子显微镜（TEM）显示裸AuNPs（平均直径约13 nm）具有良好的分散性（图3A和B）。修饰后未观察到明显聚集，而动态光散射（DLS）测量的流体力学直径从13.7 nm增加到约57.7 nm。流体力学尺寸的增加可能归因于形成了含核酸和蛋白质的表面生物分子层，表明表面功能化成功。UV-Vis光谱（图3C）显示AuNP在520 nm处的特征吸收峰，修饰后出现明显红移，证实功能化成功。FAM标记核酸链的荧光表征（图3D）和TMB-H₂O₂比色 assay（图3E）分别进一步验证了核酸和HRP的固定。Zeta电位测量（图3F）显示修饰使表面电荷从−15.3 mV变为−25.4 mV（Ab2-AuNPs-S）和−22.1 mV（HRP-AuNPs-H1/H2）。
【数据】AuNP与HRP体积比：100:3；HRP浓度：10 mg·mL⁻¹；裸AuNP平均直径：约13 nm；流体力学直径：13.7 nm → 约57.7 nm；UV-Vis吸收峰：520 nm；Zeta电位：−15.3 mV → −25.4 mV（Ab2-AuNPs-S）、−22.1 mV（HRP-AuNPs-H1/H2）
修饰AuNPs的HCR启动能力及反应条件优化
利用AuSi纳米结中的原位PE信号转换，通过简单的强度 interrogation实现了自包含的片上生物传感。然而，1.3 × 10⁻⁵ RIU的LOD不足以检测早期感染中的超痕量HIV-1 p24，这源于生物分子结合引起的有限折射率扰动。此外，CL传感信号强度本质上受鲁米诺-H₂O₂系统反应密度与……（原文此处截断）
【数据】PE LOD：1.3 × 10⁻⁵ RIU；原文此处截断，后续数据未详述
讨论与解读
本研究开发了一种级联放大的PE-CL双模式微流控生物传感器，充分发挥两种独立信号转导途径的协同互补优势，实现了HIV-1 p24抗原的超灵敏、特异和可靠定量。传感器整合了定向抗体固定、金纳米颗粒辅助的蛋白质到核酸信号转换以及基于HCR的核酸扩增，协同增强传感灵敏度和特异性。在0.01–10 ng/mL范围内呈现良好的线性响应，检出限分别为5.58 pg/mL（PE模式）和2.27 pg/mL（CL模式）。PE模式提供实时动态监测和强抗干扰能力，用于可靠的初步评估；CL模式提供超高灵敏度和低背景，用于精确定量痕量目标。两者的互补性确保了对低丰度p24的可靠检测。两种传感信号可互为参考进行结果验证，有助于区分源于样品干扰的信号偏差。人血清样品分析准确度高，回收率为94.0%–106.1%，验证了其在复杂生物体液中的强基质兼容性。总体而言，该生物传感平台作为早期HIV生物标志物检测的实验室概念验证是成功的，其高灵敏度、强特异性和基质兼容性具有广阔的应用前景。
编译者解读：该研究的方法学亮点在于将SPR热电子发射与HCR级联放大整合到同一微流控芯片，PE与CL两种物理机制独立读出、互为验证，有效规避了单一模式在复杂基质中的假阳性风险。AuSi光栅的亚5 nm线宽SPR使PE模式具备实时动态监测能力，而CL模式弥补了PE在超痕量检测中的灵敏度不足。局限在于总检测时间约4 h，且目前仅为实验室概念验证，微流控芯片的批间一致性与长期稳定性尚需验证。若能与便携式读出设备结合，该双模式策略有望拓展至其他早期感染标志物的现场检测。
参考来源
期刊：Microchemical Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.microc.2026.119668
DOI: 10.1016/j.microc.2026.119668