来源：A multimodal colorimetric biosensor for bisphenol A based on DNA walker signal amplification and the formation of a molybdophosphoric acid-brilliant green complex（Microchemical Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
双酚A（BPA）是一种广泛存在于食品与环境基质中的内分泌干扰物，长期暴露威胁人体健康。本研究构建了一种智能手机辅助的多通道比色生物传感器，将BPA适配体激活的DNA步行器、碱性磷酸酶（ALP）催化水解与磷钼酸比色分析相集成。该传感器建立了紫外-可见分光光度法、智能手机RGB比色法和棉签传感器三种检测模式，检出限分别为0.028、0.035和0.088 ng/mL，在牛奶实际样品中加标回收率为93.6%–106.5%，为食品安全现场监测提供了低成本、多场景适配的检测平台。
研究背景
双酚A是合成聚碳酸酯塑料、环氧树脂及各类食品包装材料时广泛使用的单体。由于应用广泛，BPA容易从包装容器和热敏纸中迁移进入食品和日常饮品，长期的人体暴露对生理健康构成重大威胁。作为一种典型的内分泌干扰化学物，BPA通过模拟或拮抗内源性激素干扰人体内分泌稳态，可能诱发一系列不良生物学效应，包括生殖障碍、免疫功能障碍、发育神经毒性以及癌症风险增加。鉴于其高健康风险，欧盟、美国食品药品监督管理局以及中国国家卫生健康委员会等全球监管机构均已制定标准化的BPA迁移限量以进行风险控制。例如，欧盟建立了4 μg/kg体重的每日耐受摄入量阈值，而中国国家标准GB/T 23296.16–2009规定食品模拟物中BPA的检出限为0.3 μg/mL。在此背景下，开发快速、灵敏、可靠的双酚A检测分析策略对食品安全监管和公共卫生保护至关重要。目前，常规的BPA定量检测主要依赖实验室分析技术。
研究方法
2.1 药品与试剂
双酚A（BPA）、生物素标记的底物探针（Bio-substrate probes）、链霉亲和素修饰的磁珠（SA-MPs）以及所有DNA序列（汇总于表S1，见补充材料）均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。三(2-羧乙基)膦（TCEP）购自Sigma-Aldrich（上海）有限公司。碱性磷酸酶（ALP）由上海麦克林生化科技有限公司提供。交联剂磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯（Sulfo-SMCC）购自北京美瑞达科技有限公司。4-硝基苯基磷酸二钠六水合物（4-NPP）、钼酸铵((NH₄)₆Mo₇O₂₄)和亮绿（BG）购自上海阿拉丁生化科技有限公司。Tween-20和Tween-80来自北京欣盛百特科技有限公司。所有化学试剂均为分析纯，未经进一步纯化直接使用。实验全程使用由Milli-Q水纯化系统制备的电阻率为18.2 MΩ·cm的超纯水。所有缓冲溶液的详细组成列于表S2（见补充材料）。
【数据】试剂来源：生工生物、Sigma-Aldrich、麦克林、美瑞达、阿拉丁、欣盛百特；超纯水电阻率：18.2 MΩ·cm；试剂纯度：分析纯
2.2 设备与仪器
本工作使用的实验仪器包括：Milli-Q超纯水系统（UPT-II-10 T，四川优普超纯科技有限公司）、恒温电热鼓风干燥箱（HGZF-II/H-101-0，上海跃进医疗器械有限公司）、高速离心机（TGL-16G，上海安亭科学仪器厂）、磁力搅拌器（MS-H280-Pro，北京兰杰柯科技有限公司）、pH计（FE28，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）、超声波清洗器（KQ218，昆山超声仪器有限公司）、商用智能手机（小米，小米科技有限公司）以及紫外-可见分光光度计（普析T9，重庆瑞利电子仪器设备有限公司）。
【数据】超纯水系统：UPT-II-10 T；干燥箱：HGZF-II/H-101-0；离心机：TGL-16G；磁力搅拌器：MS-H280-Pro；pH计：FE28；超声波清洗器：KQ218；智能手机：小米；紫外-可见分光光度计：普析T9
2.3 SP-ALP探针的合成
为制备SP-ALP探针，将40 μL 10 μM生物素标记底物探针（Bio-substrate probe）与4 μL 10 mM TCEP溶液及10 μL PBS2缓冲液混合。混合物在室温下孵育1 h以还原底物DNA中的二硫键，随后使用Amicon-3 K超滤管以PBS1缓冲液进行纯化。同时，将100 μL 4 μM ALP溶液与10 μL 2 mM Sulfo-SMCC溶液（溶于PBS1中配制）混合，在室温下孵育1 h，使交联剂与ALP的游离氨基共价结合。反应混合物使用Amicon-10 K超滤管以PBS1缓冲液纯化，以去除残余的过量交联剂。将两种纯化后的溶液充分混合，在4 °C下孵育8 h以促进偶联。反应结束后，使用Amicon-10 K超滤管以Tris-1缓冲液去除未反应的游离底物探针。所得SP-ALP偶联物稀释至终体积100 μL，于4 °C保存以备后续实验使用。
【数据】Bio-substrate probe：40 μL、10 μM；TCEP：4 μL、10 mM；PBS2：10 μL；室温孵育：1 h；ALP：100 μL、4 μM；Sulfo-SMCC：10 μL、2 mM；室温孵育：1 h；偶联温度：4 °C；偶联时间：8 h；终体积：100 μL；保存温度：4 °C
2.4 DNA步行器的组装
首先，将20 μL 10 μM DNAzyme与40 μL 10 μM BPA适配体在PCR管中与适量杂交缓冲液混合。混合物在90 °C加热10 min，自然冷却至室温以实现完全碱基配对杂交，形成锁定的适配体/生物-DNAzyme复合物。随后，将100 μL合成的SP-ALP探针和60 μL预制适配体/生物-DNAzyme复合物依次加入60 μL链霉亲和素修饰磁珠（SA-MPs，10 mg/mL）中。混合溶液在37 °C孵育1 h以完成组装。依靠生物素-链霉亲和素的高亲和力相互作用，SP-ALP探针和锁定DNAzyme复合物稳定固定于SA-MP表面，构建DNA步行器纳米系统。组装后的DNA步行器重悬于600 μL Tris 2缓冲液中，于4 °C保存以备后续传感检测。
【数据】DNAzyme：20 μL、10 μM；BPA适配体：40 μL、10 μM；加热温度：90 °C；加热时间：10 min；SP-ALP探针：100 μL；适配体/生物-DNAzyme复合物：60 μL；SA-MPs：60 μL、10 mg/mL；组装温度：37 °C；组装时间：1 h；重悬体积：600 μL；保存温度：4 °C
2.5 BPA检测
对于BPA检测，将50 μL制备好的DNA步行器溶液磁分离弃去上清Tris 2缓冲液。随后加入含梯度浓度BPA的Tris-3缓冲液，混合物在37 °C孵育80 min以触发靶标激活的DNA步行器循环。孵育结束后，再次磁分离收集富含游离ALP的上清液。收集的上清液与4-NPP底物混合，ALP在37 °C催化底物水解生成大量Pi。之后，将对应不同BPA浓度的200 μL水解产物转移至100 μL酸性钼酸铵溶液中。在酸性条件下，生成的Pi与钼酸铵反应形成12-MPA。最后，向体系中加入300 μL 10 μM BG溶液。黄色BG染料与12-MPA特异性络合，产生从黄色到绿色的渐变颜色转变。颜色强度与Pi浓度正相关，间接反映初始BPA含量。靶标识别和ALP催化水解步骤在37 °C进行，后续比色检测步骤在室温下进行。
【数据】DNA步行器溶液：50 μL；BPA孵育温度：37 °C；BPA孵育时间：80 min；水解产物：200 μL；酸性钼酸铵溶液：100 μL；BG溶液：300 μL、10 μM；靶标识别与酶催化温度：37 °C；比色检测温度：室温
2.6 棉签比色生物传感器的制备
将市售医用棉签浸入0.7%（w/w）Tween-80溶液中，超声处理10 min以提高棉纤维的亲水性和试剂负载能力。随后加入5 mL BG溶液，再超声处理5 min，之后静置孵育2 h以确保BG在棉纤维上均匀吸附。取出棉签在60 °C干燥30 min，获得BG功能化棉签，再将其浸入酸性钼酸铵溶液中，将钼酸盐试剂负载到纤维表面。将制备好的棉签浸入含梯度Pi浓度的ALP水解产物中，该水解产物收集自2.5节中ALP催化后的上清液。在酸性条件下，Pi与钼酸铵反应生成12-MPA。BG与12-MPA之间的特异性络合使棉签尖端产生从黄色到绿色的可见颜色变化，颜色强度随Pi水平增加而增强。所有棉签样品用智能手机拍照，并从图像中提取相应的RGB值。建立RGB信号与BPA浓度之间的校准曲线，以实现快速视觉定量检测。棉签比色生物传感器的整体制备和检测流程见图S1（见补充材料）。
【数据】Tween-80浓度：0.7%（w/w）；超声时间：10 min；BG溶液体积：5 mL；第二次超声：5 min；静置孵育：2 h；干燥温度：60 °C；干燥时间：30 min
2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳表征
进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）以验证DNA组分的成功组装和反应可行性。使用1× TBE缓冲液作为运行电解质制备10%非变性聚丙烯酰胺凝胶。所有DNA样品调整至统一浓度4 μM，每个样品取10 μL加载至凝胶孔中。电泳分两个阶段进行：先在80 V恒压下预电泳10 min，随后在120 V下正式电泳约60 min。电泳结束后，凝胶在暗处用4S Green核酸染料染色20 min，用去离子水冲洗以去除残余染料。凝胶条带图案最终使用Tanon 5200多功能化学发光和荧光成像系统可视化并记录。
【数据】凝胶浓度：10%非变性聚丙烯酰胺；运行缓冲液：1× TBE；DNA样品浓度：4 μM；上样量：10 μL；预电泳：80 V、10 min；正式电泳：120 V、约60 min；染色时间：20 min；染色条件：暗处
2.8 实际样品中BPA的检测
选择牛奶作为典型食品基质以验证所提出生物传感器的实际适用性。牛奶样品分为三组，分别加标BPA至终浓度50、100和500 ng/mL，每个浓度平行测定三次以进行统计分析。
【数据】样品基质：牛奶；加标浓度：50、100、500 ng/mL；平行测定次数：3次
研究结果
3.1 所提出策略的原理设计与检测机制
本工作采用高特异性BPA适配体作为识别单元，构建BPA响应型且由DNAzyme驱动的DNA步行器传感系统。整体检测原理如图1所示，其中BPA的定性和定量检测被成功转化为对ALP催化水解4-NPP所产生Pi的灵敏测量。作为特异性靶向寡核苷酸，BPA适配体可优先与BPA分子结合并发生明显的构象重排，进一步触发预杂交DNAzyme序列的解离。释放的DNAzyme随后结合预制的SP-ALP探针，并在Zn²⁺辅因子存在下切割生物素化底物探针的rA位点。这种切割打破了DNA步行器系统的初始静态，将化学能转化为机械运动，使DNAzyme能够沿预定轨道自主定向行走。得益于连续的循环切割反应，大量ALP分子被丰富地释放到上清液中。磁分离后，收集的含高水平游离ALP的上清液可高效催化补充的4-NPP底物水解，从而产生大量Pi用于后续比色信号输出。在酸性条件下，ALP催化水解4-NPP产生的Pi与钼酸盐反应形成12-MPA。加入BG后，染料与该复合物相互作用，诱导溶液产生浓度依赖性的颜色变化（图2A和B）。因此，较高的BPA浓度触发更多DNAzyme释放，导致切割后更多游离ALP的释放，进而产生更高的Pi产量。随着Pi浓度增加，溶液颜色逐渐从黄色变为绿色（图2C）。基于这一原理，建立了三种比色检测模式用于BPA快速定量分析。第一种模式利用基于智能手机的RGB比色法进行现场快速检测。使用智能手机在LED光源下拍摄对应不同BPA浓度的反应溶液图像。获取的JPEG图像导入颜色检测APP，通过RGB值（R=红，G=绿，B=蓝）量化颜色强度。随后建立RGB值与BPA浓度之间的校准曲线。第二种模式采用紫外-可见分光光度法，通过测量650 nm处的吸光度建立与BPA浓度的定量关系，实现实验室精确定量。第三种模式是基于棉签的比色生物传感器。普通医用棉签经Tween-80处理增强亲水性，然后依次负载BG和酸性钼酸铵溶液，干燥后获得功能化棉签。浸入ALP水解产物后，棉签头部颜色随Pi浓度增加从黄色变为绿色，通过智能手机RGB分析实现定量检测。
【数据】检测波长：650 nm；RGB通道：R=红、G=绿、B=蓝；DNAzyme辅因子：Zn²⁺；颜色变化：黄色→绿色
3.2 检测方案的可行性验证
为验证基于DNA步行器的比色传感策略用于BPA检测的可行性，首先通过PAGE检查了BPA触发DNA步行器启动的关键步骤。如图3A所示，泳道1为DNA marker；泳道2底物探针显示单一完整条带，无降解；泳道3对应游离DNAzyme；泳道4对应BPA适配体；泳道5显示锁定的DNAzyme（适配体/生物-DNAzyme），呈现单一清晰条带；共存探针保持完整，表明在无靶标分子时DNAzyme的切割活性无法被触发；泳道6代表加入BPA后的体系，其中DNAzyme条带消失，同时其下方出现新的小分子DNA片段条带。这些结果表明BPA特异性结合适配体，释放DNAzyme并成功切割底物探针，从而证实DNA步行器被有效激活。为研究BG与12-MPA之间的显色络合机制，考察了各单一组分及混合体系的紫外-可见吸收光谱和溶液外观（图3B）。对照实验显示，Pi与钼酸铵的混合物（红线，插图管a）在可见光区（>400 nm）无特征吸收，呈无色透明，表明生成的12-MPA杂多酸本身无可见光吸收。BG-钼酸铵体系（黑线，插图管b）在约450 nm处显示质子化BG的本征π-π跃迁峰。由于在蓝紫区的吸收，互补色使宏观溶液呈淡黄色。然而，当三种组分共存触发显色反应时（绿线，插图管c），发生了关键的光谱结构变化：在650 nm处出现明显的新强吸收峰，与450 nm峰共同形成双波段吸收特征。这一新650 nm峰的出现直接证实了阳离子BG与高负电荷12-MPA阴离子之间通过静电吸引形成了超分子离子对复合物。总体而言，这些对照实验和光谱演变明确证实了绿色12-MPA-BG复合物的形成。进一步进行紫外-可见分析以验证比色检测途径的可行性。如图3C所示，含BPA的体系在650 nm处显示明显吸收峰，而无BPA对照则无明显吸收峰。这表明BPA有效触发了级联信号转导链：DNA步行器—ALP—Pi—12-MPA-BG，从而产生明显的比色信号。总之，基于DNA步行器的比色传感策略成功完成了从BPA特异性触发、经酶催化到12-MPA-BG显色反应的完整信号转换，证实了所提出方法的可行性。
【数据】PAGE凝胶浓度：10%；DNA样品浓度：4 μM；上样量：10 μL；BG-钼酸铵体系吸收峰：约450 nm；12-MPA-BG复合物吸收峰：650 nm；可见光区范围：>400 nm
3.3 实验条件优化
为获得BPA的最佳检测性能，对反应时间、BG浓度、酸性钼酸铵浓度和pH等关键参数进行了系统优化。首先优化BPA与适配体的反应时间。BPA与适配体的特异性结合对于Zn²⁺依赖性DNAzyme的形成和DNA步行器的启动至关重要。如图4A所示，溶液吸光度随反应时间逐渐增加，先上升后达到平台。80 min后，更长的反应时间未观察到吸光度显著增加。因此，选择80 min作为最佳反应时间。为考察钼酸铵浓度对检测性能的影响，在1至20 mM浓度范围内监测反应体系的吸光度。如图4B所示，吸光度随钼酸铵浓度升高而快速增加，随后进入稳定平台期。这一趋势表明，一旦浓度超过5 mM，Pi已在磷钼杂多酸形成中大部分被消耗，进一步增加钼酸铵浓度对吸光度的增强可忽略不计。因此，选择5 mM作为最佳浓度，兼顾充分的络合效率与最小的试剂消耗和背景干扰。BG作为该体系中的显色指示剂，特异性结合磷钼杂多酸形成有色复合物并诱导明显的颜色变化，从而提高Pi检测的灵敏度。如图4C所示，在低BG浓度下……
【数据】BPA-适配体最佳反应时间：80 min；钼酸铵浓度范围：1–20 mM；钼酸铵最佳浓度：5 mM
3.4 三种检测模式的分析性能
（注：原文节选未包含此节完整内容，以下为根据摘要及讨论部分可提取的信息。）
所提出的生物传感器对BPA结构类似物表现出优异的选择性，具有良好的重现性，在真实牛奶样品检测中获得了满意的加标回收率。三种检测模式的分析性能如下：紫外-可见分光光度法在0.1–1000 ng/mL范围内呈现良好线性关系，检出限为0.028 ng/mL；基于智能手机的RGB比色法检出限为0.035 ng/mL，适用于现场快速筛查；棉签传感器检出限为0.088 ng/mL，可实现无仪器家庭自测。
【数据】紫外-可见分光光度法线性范围：0.1–1000 ng/mL；紫外-可见分光光度法LOD：0.028 ng/mL；智能手机RGB比色法LOD：0.035 ng/mL；棉签传感器LOD：0.088 ng/mL
3.5 选择性、抗干扰性与重现性
（注：原文节选未包含此节完整内容，以下为根据摘要及讨论部分可提取的信息。）
该传感器对BPA结构类似物表现出优异的选择性，批内RSD为3.17%。牛奶样品中加标回收率为93.6%–106.5%，与HPLC结果相比绝对相对误差低于5%。
【数据】批内RSD：3.17%；牛奶加标回收率：93.6%–106.5%；与HPLC绝对相对误差：<5%
讨论与解读
本工作构建了一种智能手机辅助的多通道比色生物传感器，将DNA步行器与磷钼酸-BG显色反应相集成，用于BPA的高灵敏、高选择性检测。该策略以BPA适配体作为特异性识别元件激活DNAzyme驱动的DNA步行器，后者自主进行循环切割以释放ALP。释放的ALP催化4-NPP水解产生无机Pi。利用磷钼酸和辅助比色探针BG，该过程最终产生从黄色到绿色的比色信号。基于此原理建立了三种检测模式：紫外-可见分光光度法在0.1–1000 ng/mL范围内呈现良好线性关系，LOD为0.028 ng/mL；智能手机RGB比色法LOD为0.035 ng/mL，适用于现场快速筛查；棉签传感器LOD为0.088 ng/mL，可实现无仪器家庭自测。该传感器对BPA结构类似物表现出优异的选择性，批内RSD为3.17%。牛奶样品中加标回收率为93.6%–106.5%，与HPLC结果相比绝对相对误差低于5%。该策略具有低成本、操作简单、灵活适配多种场景的优势，为食品安全监测提供了可靠的现场检测工具。
编译者解读：该研究在方法设计上巧妙地将核酸适配体的特异性识别、DNA步行器的等温循环放大与经典磷钼酸比色反应相耦合，实现了从分子识别到肉眼可见信号的级联转换。三种检测模式的梯度设计——从实验室精确定量到智能手机现场筛查再到棉签家庭自测——体现了合成生物学"场景适配"的工程思维。然而，DNA步行器在复杂基质中的稳定性、棉签传感器的批间一致性以及适配体对其他双酚类物的交叉反应风险，仍是走向实际应用需要持续验证的问题。
参考来源
期刊：Microchemical Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.microc.2026.119335
DOI: 10.1016/j.microc.2026.119335