来源：A triple-signal-amplified colorimetric biosensor based on 3D-DNA-walker and hybridization chain reaction for sensitive detection of tetracycline residues（Talanta）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
四环素类抗生素在食品基质中的残留持续威胁食品安全。本研究构建了一种三重信号放大比色生物传感器，将适配体识别、三维DNA步行器、杂交链反应与G-四链体DNA酶催化集成于一体。目标物结合后，适配体释放多条互补DNA链，触发链置换并激活DNA步行器持续产生信号，随后引发HCR形成富含G-四链体的纳米结构，经hemin嵌入后催化ABTS氧化显色。该传感器对母体四环素的检测限达0.00326 ng/mL，线性范围0.005–10 ng/mL，加标生牛乳回收率98.8%–104.0%。
研究背景
四环素（TET）是一种广谱抗生素，因成本低、抗菌效果确切，被广泛用于临床治疗和畜牧养殖。大量使用导致其在食品和环境中的持久残留，引发抗生素耐药性及经食物链危害人体健康的担忧。传统检测方法如高效液相色谱、毛细管电泳和液相色谱-串联质谱具有高灵敏度、高准确度和多残留确认分析能力，但依赖精密仪器、样品前处理复杂且需要专业操作人员，在仪器受限的分析场景中应用受限。因此，将特异性分子识别与灵敏信号转导相结合的生物传感方法因操作简便、对大型仪器依赖度低而受到越来越多关注。适配体是通过指数富集配体系统进化技术（SELEX）筛选获得的单链DNA或RNA寡核苷酸，可折叠成特定三维结构，为构建灵敏检测系统提供了可编程的分子识别途径。
研究方法
2.1 化学试剂与材料
本研究所用全部寡核苷酸序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司化学合成，并经HPLC纯化。详细序列列于表1。本研究所用适配体命名为Apt76，对应Niazi、Lee和Gu采用改良Toggle-SELEX策略结合Flu-Mag SELEX筛选获得的T20适配体。该76-mer单链DNA适配体报道与TET结合的解离常数为63.6 nM，在测试的四环素类似物中对TET表现出优先结合。序列设计高度关联；相同颜色代表互补配对，链内粗体和斜体区域表示形成发夹结构茎部的自互补区域。基于Apt76的序列和已报道的结合特性，cDNA序列根据分子对接模拟进行理性设计，以覆盖Apt76与TET结合涉及的关键核苷酸碱基，在表1中以黄色高亮标注。Apt76相对较长的序列使得能够在不同结合相关区域设计多条cDNA链，这是构建目标触发“一对多”释放策略所必需的。相比之下，较短的适配体序列通常提供较少的可用区域来引入多条预杂交cDNA而不干扰目标识别。为尽量减少TET可能的氧化降解，整个实验中使用新鲜配制的TET工作液。工作液在使用当天通过储备液系列稀释制备，配制和分析过程中避光，并立即用于识别反应。每次实验后未使用的TET工作液即弃。其他试剂的详细信息见补充材料。
【数据】适配体：Apt76（76-mer ssDNA）；解离常数：63.6 nM；cDNA互补长度：8、12、16 nt；TET工作液：当天新鲜配制、避光；原文未详述其他试剂具体用量
2.2 仪器
吸收光谱、吸光度值和荧光光谱使用SpectraMax i3X酶标仪（Molecular Devices，美国）的可见光和荧光检测模块记录。所有光谱采集分辨率为1 nm。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）使用电泳分析仪进行，并通过Alliance Q9 Advanced紫外成像系统（UVItec Ltd.，剑桥，英国）可视化。电泳在0.5× TBE缓冲液中以150 V恒压运行50 min。旋转摇床购自宁波新芝生物科技股份有限公司，PB-10 pH计购自德国Sartorius AG。
【数据】光谱分辨率：1 nm；电泳缓冲液：0.5× TBE；电压：150 V；电泳时间：50 min；仪器：SpectraMax i3X酶标仪、Alliance Q9 Advanced紫外成像系统
2.3 cDNAs-Apt76-MBs复合物的制备
生物素化Apt76适配体通过链霉亲和素-生物素偶联固定在磁珠（MBs）上，随后与cDNAs杂交。简要步骤：100 μL MB（10 mg/mL）用1 mL洗涤缓冲液洗涤两次。磁珠与500 μL Apt76溶液（洗涤缓冲液中1 μM，最终MB浓度为2 mg/mL）在25 °C旋转混匀器上孵育30 min。洗涤三次后，Apt76-MBs重悬于TE缓冲液（100 μL）中，4 °C保存。对于cDNA加载，50 μL Apt76-MBs与cDNAs（1 μM，杂交缓冲液）在25 °C孵育2 h。最终cDNA-Apt76-MB偶联物洗涤后4 °C保存。
【数据】MB用量：100 μL（10 mg/mL）；洗涤缓冲液：1 mL×2次；Apt76浓度：1 μM（500 μL）；最终MB浓度：2 mg/mL；孵育温度：25 °C；孵育时间：30 min；洗涤次数：3次；重悬体积：TE缓冲液100 μL；保存温度：4 °C；cDNA浓度：1 μM；cDNA孵育时间：2 h
2.4 三维DNA步行器的组装
三维DNA步行器通过在MBs上组装Walking probe/Lock DNA双链体（WL）和发夹底物H1构建。Walking probe与Lock DNA以1:5摩尔比在退火缓冲液中混合，加热至95 °C保持10 min，缓慢冷却形成WL双链体。H1链在95 °C变性10 min，冷却至25 °C，稀释至1 μM。洗涤MBs（200 μL，10 mg/mL）后，加入950 μL H1和50 μL WL双链体，混合孵育30 min。随后洗涤磁珠并重悬于200 μL TE缓冲液中，4 °C保存。
【数据】Walking probe:Lock DNA摩尔比：1:5；退火温度：95 °C；退火时间：10 min；H1变性温度：95 °C；H1变性时间：10 min；H1冷却温度：25 °C；H1浓度：1 μM；MB用量：200 μL（10 mg/mL）；H1体积：950 μL；WL体积：50 μL；孵育时间：30 min；重悬体积：TE缓冲液200 μL；保存温度：4 °C
2.5 三重信号放大比色生物传感器的优化
优化分三个阶段进行：（1）Apt76-cDNA杂交：评估不同互补长度（8、12、16 nt）的cDNAs。（2）三维DNA步行器：测试WL/H1比例（1:5、1:10、1:15、1:30和1:50）以最大化步行效率。（3）HCR扩增：优化H2和H3浓度（0.2、0.5、1、2、5、10、20和30 μM）以促进G-四链体形成。以418 nm处的吸光度比（A/A0）作为优化标准（A：含TET；A0：不含TET）。同时系统考察了反应温度和孵育时间。
【数据】cDNA互补长度：8、12、16 nt；WL/H1比例：1:5、1:10、1:15、1:30、1:50；H2/H3浓度：0.2、0.5、1、2、5、10、20、30 μM；检测波长：418 nm；优化标准：A/A0
2.6 TET检测流程
使用三重信号放大比色生物传感器检测TET按三个连续步骤进行：（1）识别：20 μL cDNA-Apt76-MBs（2 mg/mL）与20 μL不同浓度新鲜配制的TET工作液（0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10和20 ng/mL）孵育。磁分离后收集上清液。（2）三维DNA步行器反应：20 μL三维DNA步行器（2 mg/mL）与上清液和DNA酶缓冲液孵育。加入Zn²⁺（50 mM，1 μL）后，反应混合物孵育1 h，随后磁分离并洗涤。（3）HCR和比色读出：预退火的H2/H3发夹与DNA步行器产物混合，随后加入hemin（10 μL，10 μM）和比色缓冲液。孵育40 min后，加入ABTS（10 μL，40 mM）和H2O2（10 μL，40 mM）。5 min后测量418 nm处吸光度。根据A/A0值确定TET浓度。从当地超市购买的生牛乳用作食品基质以评估所提生物传感器的适用性。生牛乳样品在预处理前人工加标TET，然后进行三氯乙酸辅助蛋白沉淀、超声提取、离心、过滤和pH调节，具体如补充材料所述。分析结果进一步通过与超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS）获得的结果比较进行验证。
【数据】cDNA-Apt76-MBs用量：20 μL（2 mg/mL）；TET浓度梯度：0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20 ng/mL；三维DNA步行器用量：20 μL（2 mg/mL）；Zn²⁺浓度：50 mM；Zn²⁺体积：1 μL；步行器反应时间：1 h；hemin浓度：10 μM；hemin体积：10 μL；HCR孵育时间：40 min；ABTS浓度：40 mM；ABTS体积：10 μL；H2O2浓度：40 mM；H2O2体积：10 μL；显色时间：5 min；检测波长：418 nm；验证方法：UHPLC-MS
研究结果
3.1 三重信号放大比色生物传感器的原理
本研究开发了一种具有可视化显色的三重信号放大比色生物传感器，用于TET的灵敏检测，基于级联放大策略，包括目标触发的构象转换（图1A）、三维DNA步行器介导的信号增强（图1B）和杂交链反应（图1C）。具体而言，生物素化Apt76适配体固定在链霉亲和素包被的MBs上，并与多条互补DNA链（cDNAs）杂交形成cDNAs-Apt76-MBs复合物。识别TET后，适配体发生构象变化，释放多条cDNAs，通过“一对多”释放机制实现第一级信号放大。这些cDNAs启动三维DNA步行器，该步行器由含DNA酶的Walking probe、Lock DNA和含核糖核苷酸的发夹底物（H1）组成，全部组装在MBs上。激活后，步行器催化切割H1并沿DNA轨道移动，产生大量S1链作为第二级放大。释放的S1序列随后通过打开发夹结构H2和H3触发HCR，形成嵌入G-四链体（G4）基序的长双链DNA聚合物。在hemin存在下，这些G4/hemin DNA酶催化H2O2介导的ABTS²⁻氧化为ABTS•⁺，产生肉眼可见的明显颜色变化，从而实现TET检测的可视化显色。这种三层放大机制在分子水平上实现协同放大，为TET检测提供灵敏的比色读出。
【数据】放大层级：三级（适配体释放、DNA步行器、HCR）；信号输出：ABTS²⁻氧化为ABTS•⁺；检测方式：肉眼可见颜色变化+吸光度；原文未详述其他具体数值
3.2 三重信号放大比色生物传感器的可行性分析
采用Native PAGE评估设计的DNA链之间链置换、切割和组装反应的可行性，以及三重级联放大策略的整合。在图2A中，WL双链体有效隔离了Walking probe的DNA酶催化结构域，阻止其与H1相互作用，表现为仅存在WL和H1条带（图2A，泳道6）。TET诱导释放后，cDNAs与Lock DNA杂交破坏WL双链体，释放DNA酶序列并使H1在核糖核苷酸位点被切割，产生两个低分子量片段。因此，泳道7显示WL和H1条带消失，同时出现cDNAs/Lock DNA和切割产物。当仅存在H1或H1与WL时（图2A，泳道11和12），H2和H3保持清晰条带；相反，加入cDNA-1（图2A，泳道13）导致H2/H3条带减弱并出现高分子量弥散带，证实HCR启动。图2A表明TET诱导的cDNAs释放可成功破坏WL双链体、释放DNA酶序列并启动H1切割。图2B验证了在实际cDNAs-Apt76-MBs传感配置下生物传感器对TET的识别。由于Apt76-cDNA双链体形成不遮蔽cDNA与Lock DNA互补的区域，采用磁分离cDNAs-Apt76-MBs以确保准确评估。将20 μL 100 ng/mL TET与20 μL 2 mg/mL cDNAs-Apt76-MBs孵育，随后磁分离，所得上清液含能够触发下游反应的cDNAs，而空白对照（用反应缓冲液替代TET）则不能。在无TET时（图2B，泳道1），仅观察到WL和H1条带；有TET时（图2B，泳道2），WL消失且H1被切割，证实TET介导的DNA酶催化激活。图2B-泳道4中特征性HCR条带进一步表明进入第三级放大阶段。图2B验证了仅在TET存在时DNA酶切割的特异性激活。图2C展示了通过G-四链体DNA酶的过氧化物酶模拟活性产生比色信号。H2+H3（图2C，曲线a）、H1+H2+H3（图2C，曲线b）、H1+WL+H2+H3（图2C，曲线c）或cDNAs-Apt76-MBs上清液+H1+WL+H2+H3（图2C，曲线d）的组合仅产生微弱背景吸光度，表明无G-四链体形成。相反，TET诱导从cDNAs-Apt76-MBs释放cDNAs启动了两种DNA酶系统的顺序激活，产生显著颜色变化和可测量吸光度信号（图2C，曲线e）。图2C表明仅含TET的完整系统产生显著吸光度信号和可见颜色变化，证实信号转导成功。
【数据】TET浓度：100 ng/mL；cDNAs-Apt76-MBs用量：20 μL（2 mg/mL）；孵育体积：20 μL+20 μL；PAGE泳道：6、7、11、12、13、1、2、4；曲线：a、b、c、d、e；原文未详述吸光度具体数值
3.3 生物传感器检测参数的优化
cDNAs-Apt76-MBs复合物中cDNAs与Apt76之间的杂交亲和力在调节TET响应中cDNAs释放效率方面起关键作用。互补碱基数增加增强双链体稳定性，降低TET诱导链置换的可能性。相反，互补碱基过少导致双链体不稳定，引起反应条件下cDNAs的非特异性释放。为优化传感性能，我们考察了互补碱基数对生物传感器响应的影响。基于Apt76的两个关键结合域设计了六条互补序列，分别含8、12或16个互补碱基。其杂交位置如图3A所示。如图3B所示，含12个互补碱基的序列（cDNA-1和cDNA-2）产生最高A/A0比值。相比之下，8碱基序列由于熔解温度低产生高背景，导致双链体不稳定和非特异性解离。16碱基序列形成过于稳定的双链体，阻碍TET与Apt76的竞争性结合。因此，选择cDNA-1-12nt和cDNA-2-12nt用于后续实验构建生物传感器。除优化cDNA长度外，还使用TET触发的FAM标记cDNAs从cDNAs-Apt76-MBs释放作为功能性结合试验，确认Apt76在固定化和cDNA杂交后保留其目标响应行为，详见补充材料图S1。这些结果也支持了本工作选择Apt76的理由。Apt76序列相对较长，允许在不同结合相关区域放置多于一条cDNA链，从而实现目标诱导的多条寡核苷酸触发物释放。这种设计在非常短的适配体序列中难以实现，因为其在保留目标响应结合的同时提供有限的cDNA杂交域引入空间。因此，Apt76特别适合本生物传感器使用的第一级“一对多”信号放大策略。
【数据】互补碱基数：8、12、16 nt；最优互补长度：12 nt（cDNA-1和cDNA-2）；8碱基：熔解温度低、高背景；16碱基：双链体过于稳定；检测指标：A/A0比值；原文未详述具体A/A0数值
三维DNA步行器是增强所开发比色传感系统灵敏度的关键放大元件。为实现最佳放大性能，系统考察了三个关键参数的影响——WL与发夹H1之间的摩尔比、Walking probe长度和阻断域长度。WL与H1的摩尔比直接决定步行效率和磁珠界面上短链富集程度。如图4A所示，使用10 ng/mL TET作为目标分析物，在不同WL:H1摩尔比下评估吸光度和A/A0值。在1:15比例下观察到最高A/A0值。更高和更低比例均导致次优信噪比性能。具体而言，过量WL限制了步行诱导切割可用的H1，从而降低短链产量。相反，H1过量降低步行效率，导致固定反应时间内短链生成不足，最终……
【数据】TET浓度：10 ng/mL；WL:H1比例：1:5、1:10、1:15、1:30、1:50；最优比例：1:15；检测指标：A/A0值；原文未详述具体A/A0数值及后续优化数据（原文节选至此中断）
3.4 分析性能与选择性评估
在优化条件下，记录了TET浓度从0.001至20 ng/mL递增时的吸收光谱（图5A）。随着TET浓度增加，418 nm处吸光度逐渐升高。图5B展示了吸光度与TET对数浓度之间的线性校准曲线，线性范围为0.005至10 ng/mL，检测限为0.00326 ng/mL。作为对比，传统dsDNA竞争传感器的荧光响应（图5C）表现出较低的灵敏度。
【数据】TET浓度范围：0.001–20 ng/mL；线性范围：0.005–10 ng/mL；检测限：0.00326 ng/mL；检测波长：418 nm；原文未详述校准曲线具体参数
选择性评估考察了该生物传感器对母体TET、四环素家族类似物及代表性非目标抗生素的响应（图6）。该传感器对TET表现出显著高于其他类似物和非目标抗生素的响应。
【数据】目标物：母体TET；干扰物：四环素家族类似物、代表性非目标抗生素；原文未详述具体吸光度数值
在加标生牛乳样品中，回收率为98.8%–104.0%，相对标准偏差（RSDs）为0.1%–1.5%。结果与UHPLC-MS分析一致。
【数据】加标基质：生牛乳；回收率：98.8%–104.0%；RSDs：0.1%–1.5%；验证方法：UHPLC-MS
讨论与解读
本研究开发了一种三重信号放大比色生物传感器，集成了目标触发的“一对多”互补链释放策略、基于三维DNA步行器的酶促放大和HCR，用于母体TET的灵敏检测。该级联系统将基于适配体的分子识别转化为可视化显色和基于吸光度的定量。在优化条件下，生物传感器检测限为0.00326 ng/mL，对TET浓度0.005至10 ng/mL呈线性响应。将该生物传感器应用于TET加标生牛乳样品，回收率在98.8%至104.0%之间，RSDs为0.1%至1.5%，结果与UHPLC-MS分析一致。这些结果表明所提方法为母体TET提供了一种灵敏的比色检测策略。进一步与简化样品前处理和便携式光学读出集成可能拓宽其在食品相关基质中实际TET检测的适用性。
编译者解读：该研究的方法学价值在于将适配体的“一对多”释放与三维DNA步行器、HCR串联，实现了三级信号放大，检测限低至0.00326 ng/mL，在生牛乳基质中回收率良好且与UHPLC-MS结果一致。从合成生物学视角看，该体系本质上是将核酸分子识别与酶催化功能模块化组装，通过DNA纳米技术实现信号级联放大，展示了无细胞合成生物学在分析检测中的应用潜力。局限在于目前仅在加标生牛乳中验证，实际复杂食品基质中的表现尚待考察，且多步操作流程对现场快速检测的便捷性构成挑战。
参考来源
期刊：Talanta, 2026
DOI: 10.1016/j.talanta.2026.130052
DOI: 10.1016/j.talanta.2026.130052