来源：Bacillus subtilis is crucial for the normal growth of mycelium for Stropharia rugosoannulata（Fungal Biology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
皱环球盖菇是全球重要的商业化栽培食用菌，但其菌丝在完全灭菌基质上生长缓慢甚至完全不生长，严重制约了菌种制备。本研究从皱环球盖菇定殖基质中分离到一株促生菌T2-19，通过16S rRNA基因系统发育分析及基因组水平ANI、AAI、dDDH分析鉴定为枯草芽孢杆菌。该菌能以皱环球盖菇菌丝为“真菌高速公路”在木屑基质中长距离扩散，且不引起微生物污染症状，接种后菌丝生长速率提升8.63%–46.82%。研究为皱环球盖菇菌种生产提供了新思路。
研究背景
近年来，皱环球盖菇的栽培规模在全球范围内迅速扩大。中国大规模栽培的食用菌超过30种，但多数依赖木段或木屑栽培。木材短缺严重制约了木腐食用菌产业的进一步发展。与此同时，中国每年产生超过10亿吨农业秸秆，如稻草和玉米秸秆，除少量用于饲料和还田外，大量秸秆被浪费并造成环境污染。皱环球盖菇的栽培原料非常多样，不仅可用木屑，还可利用各类作物秸秆。此外，皱环球盖菇可与水稻、蔬菜等多种作物轮作，改善土壤肥力和微生物群落结构。因其味道鲜美、富含多种有益人体健康的营养和生物活性物质，皱环球盖菇在越来越多国家受到欢迎。皱环球盖菇栽培容易，但菌种制备困难，原因在于其生长非常缓慢。目前，皱环球盖菇的菌种制备已成为生产中的瓶颈问题。
研究方法
2.1 菌株
本研究所用皱环球盖菇菌株CCMSSC04796由中国食用菌菌种标准与检测中心（CCMSSC）提供。该菌株近年来在中国广泛栽培。菌株培养于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（Difco，美国），并于−196°C液氮中保存。使用前，将菌种接种于PDA培养基上，在25°C黑暗条件下活化培养15天。
【数据】菌株：皱环球盖菇CCMSSC04796；培养基：PDA（Difco，美国）；保存温度：−196°C；活化温度：25°C；活化时间：15天；黑暗条件
2.2 皱环球盖菇生长培养基
木屑培养基由杨树木屑组成，含水量为60%。制备好的木屑培养基装入试管中。为确定灭菌方式对皱环球盖菇菌丝生长的影响，将木屑培养基分为四个处理。处理I不灭菌，处理II在100°C下灭菌20分钟，处理III在100°C下灭菌60分钟，处理IV在121°C下高压灭菌60分钟。随后将直径为8 mm的菌丝圆片接种到这些木屑培养基上，在25°C黑暗条件下培养。接种后第16天测量菌丝定殖的基质高度，并计算菌丝生长速率（mm/d）。
【数据】培养基：杨树木屑；含水量：60%；处理I：不灭菌；处理II：100°C、20 min；处理III：100°C、60 min；处理IV：121°C、60 min；接种菌丝圆片直径：8 mm；培养温度：25°C；黑暗条件；测量时间：接种后第16天
2.3 细菌菌株的分离
将1克被皱环球盖菇菌丝完全定殖的基质在无菌条件下转入装有9 mL无菌水的三角瓶中并匀浆。悬液用无菌水进行10倍梯度稀释。取100微升稀释液涂布于营养琼脂（Huankai Microbial，中国）上，在30°C黑暗条件下培养24小时。挑取所有菌落并反复划线以获得纯培养物。进行革兰氏染色以检测所获分离物的纯度。
【数据】样品量：1 g定殖基质；稀释液：9 mL无菌水；涂布量：100 μL；培养基：营养琼脂（Huankai Microbial，中国）；培养温度：30°C；培养时间：24 h；黑暗条件
2.4 16S rDNA的扩增
使用MiniBEST细菌基因组DNA提取试剂盒Ver.3.0（Takara Bio Inc.）按照制造商说明提取细菌菌株的基因组DNA。随后使用引物对27F（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）及DNA聚合酶试剂盒（Takara Bio Inc.，日本）通过PCR扩增16S rRNA基因。PCR程序如下：95°C初始变性5分钟；然后30个循环的95°C变性30秒、56°C退火30秒、72°C延伸1分钟，最后72°C终延伸5分钟。所有扩增的PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，目标DNA使用FastPure凝胶DNA提取迷你试剂盒（Vazyme Biotech Co.，中国）纯化。PCR产物由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
【数据】DNA提取试剂盒：MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0（Takara）；引物：27F/1492R；初始变性：95°C、5 min；循环数：30；变性：95°C、30 s；退火：56°C、30 s；延伸：72°C、1 min；终延伸：72°C、5 min；凝胶浓度：1.5%琼脂糖；纯化试剂盒：FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit（Vazyme）
2.5 系统发育分析
16S rRNA基因部分序列提交至GenBank数据库。使用Ez-Taxon-e服务（www.ezbiocloud.net/eztaxon）将细菌菌株的近全长16S rRNA基因序列与近缘模式菌株序列进行比较并计算序列相似性。使用Mega 11以最大似然法构建系统发育树。使用1000次重抽样对最大似然数据进行Bootstrap分析以确定分支点的置信度。
【数据】数据库：GenBank；比对工具：Ez-Taxon-e；建树软件：Mega 11；建树方法：最大似然法；Bootstrap重抽样：1000次
2.6 全基因组分析
菌株T2-19的基因组使用Oxford Nanopore三代测序平台和Illumina HiSeq 4000平台进行测序。基因组使用SPAdes version 3.1组装。菌株T2-19的全基因组鸟枪法项目已提交至DDBJ/ENA/GenBank，登录号为JBEIVR000000000。菌株T2-19与芽孢杆菌属相关模式菌株之间的平均核苷酸一致性（ANI）值使用ANI Calculator（https://www.ezbiocloud.net/tools/ani）计算。平均氨基酸一致性（AAI）值使用AAI calculator（http://enve-omics.ce.gatech.edu/aai/index）测定。数字DNA-DNA杂交（dDDH）值使用GGDC 3.0（http://ggdc.dsmz.de/ggdc.php）计算。
【数据】测序平台：Oxford Nanopore + Illumina HiSeq 4000；组装软件：SPAdes version 3.1；登录号：JBEIVR000000000；ANI计算工具：ANI Calculator；AAI计算工具：AAI calculator；dDDH计算工具：GGDC 3.0
2.7 菌丝促生细菌的评价
将细菌分离物接种于营养肉汤培养基中，在30°C培养48小时。培养物以12,000 rpm离心1分钟，弃去上清液。细菌沉淀洗涤两次并重悬于无菌水中。悬液用无菌水梯度稀释。取100微升各稀释液滴加至高压灭菌的木屑培养基上，然后在同一位置接种直径为8 mm的菌丝圆片。细菌空白对照用无菌水代替细菌悬液，皱环球盖菇空白对照用琼脂圆片代替菌丝圆片。培养物在25°C黑暗条件下培养30天。测量菌丝生长速率。
【数据】培养基：营养肉汤；培养温度：30°C；培养时间：48 h；离心：12,000 rpm、1 min；接种量：100 μL；菌丝圆片直径：8 mm；培养温度：25°C；培养时间：30天；黑暗条件
2.8 热灭活枯草芽孢杆菌对菌丝生长的影响
将本研究确定的最佳接种浓度（1.2 × 10⁹ cfu/ml）的细菌悬液在121°C高压灭菌20分钟使其完全灭活。然后，将100 μL热灭活细菌悬液接种到完全灭菌的木屑培养基上。用无菌水代替细菌悬液作为空白对照。将含有菌丝的琼脂块（直径8 mm）接种到培养基上。所有培养物在25°C黑暗条件下培养30天，测量菌丝生长速率。每个处理设三个生物学重复。
【数据】细菌浓度：1.2 × 10⁹ cfu/ml；灭活条件：121°C、20 min；接种量：100 μL；琼脂块直径：8 mm；培养温度：25°C；培养时间：30天；生物学重复：3次
2.9 基质中芽孢杆菌存活与增殖的评估
将待测芽孢杆菌菌株在营养肉汤培养基中于30°C培养48小时。通过离心（12,000 rpm，1分钟）收集菌体，用无菌水洗涤两次，并重悬于无菌水中。悬液梯度稀释以获得五个接种浓度：1.2 × 10⁶ cfu/ml、1.2 × 10⁷ cfu/ml、1.2 × 10⁸ cfu/ml、1.2 × 10⁹ cfu/ml、1.2 × 10¹⁰ cfu/ml，对应促生试验中使用的最佳浓度。用无菌水作为空白对照以排除基质中背景微生物的干扰。将100微升各细菌稀释液接种到完全灭菌的木屑培养基上，所有处理在25°C黑暗条件下培养。在接种后第0、1、3、5、7、14、21和28天取样。在每个时间点，样品用无菌水梯度稀释，取100 μL各稀释液涂布于营养琼脂平板上。平板在30°C培养24–48小时，计数菌落形成单位（CFU）。
【数据】培养温度：30°C；培养时间：48 h；离心：12,000 rpm、1 min；接种浓度梯度：1.2 × 10⁶、1.2 × 10⁷、1.2 × 10⁸、1.2 × 10⁹、1.2 × 10¹⁰ cfu/ml；接种量：100 μL；培养温度：25°C；取样时间点：0、1、3、5、7、14、21、28天；平板培养温度：30°C；平板培养时间：24–48 h
2.10 木质纤维素酶活性测定
为确定细菌对皱环球盖菇木质纤维素酶活性的影响，设计了两个处理。对照组高压灭菌木屑培养基仅接种皱环球盖菇，处理组共接种细菌和皱环球盖菇。培养16天后，分别从试管顶部和底部取1 g被皱环球盖菇定殖的基质。样品放入10 ml磷酸缓冲液（0.1 M，pH 6.5）中匀浆。随后，悬液在4°C、12,000 rpm离心10分钟。收集上清液作为粗酶提取液用于后续测定。酶提取液的蛋白质含量使用Bradford法测定。纤维素酶活性以羧甲基纤维素钠盐（CMC）（Sigma–Aldrich）为底物进行测定。释放的葡萄糖使用3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS）法测定。一个酶单位（U）定义为在测定条件下每分钟释放1 μg葡萄糖所需的酶量。漆酶活性使用2,2′-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-……
【数据】培养时间：16天；取样量：1 g；缓冲液：10 ml磷酸缓冲液（0.1 M，pH 6.5）；离心：4°C、12,000 rpm、10 min；蛋白测定：Bradford法；纤维素酶底物：CMC（Sigma–Aldrich）；葡萄糖测定：DNS法；酶单位定义：每分钟释放1 μg葡萄糖
研究结果
3.1 基质灭菌程度对菌丝生长的影响
木屑培养基的灭菌程度对菌丝生长有显著影响。如图1所示，不完全灭菌木屑培养基（包括处理I、II和III）中的菌丝生长速率显著高于处理IV的高压灭菌木屑培养基。在不完全灭菌木屑培养基中，完全未灭菌的处理I菌丝生长速率最快，其次为100°C灭菌20分钟的处理II，再次为100°C灭菌60分钟的处理III。处理I的菌丝生长速率为4.92 mm/d，比处理IV的2.21 mm/d快122.62%。然而，处理I、II和III中部分试管有明显的微生物污染症状，其中处理I污染率最高，达30%。如图2所示，不同处理之间肉眼可见的菌丝形态存在明显差异。例如，处理I中菌丝健壮、生长旺盛，而处理IV中菌丝蓬松、生长微弱。
【数据】处理I生长速率：4.92 mm/d；处理IV生长速率：2.21 mm/d；处理I比处理IV快：122.62%；处理I污染率：30%
3.2 菌丝促生细菌的分离
为研究菌丝生长速率与木屑培养基中微生物之间的关系，取被皱环球盖菇定殖且无微生物污染症状的基质进行细菌和真菌分离检测。结果表明，四个处理中均未检测到真菌。处理I、II和III中发现了大量细菌，但处理IV中未检测到细菌。随机选取50个菌落进行纯化。用无菌水制备的细菌悬液与皱环球盖菇共接种于高压灭菌木屑培养基上。如图3所示，皱环球盖菇与细菌共接种于高压灭菌木屑培养基上生长旺盛，无任何细菌污染症状。与未接种细菌的对照相比，50株细菌中有13株对菌丝生长有抑制作用，27株无明显影响，10株对菌丝有显著促进作用。
【数据】分离菌落数：50；抑制菌丝生长：13株；无明显影响：27株；显著促进：10株；处理IV未检测到细菌；四个处理均未检测到真菌
3.3 细菌的鉴定
对10株具有菌丝促生作用的细菌进行16S rRNA基因扩增和测序，结果表明这10株菌的16S rRNA基因序列几乎完全相同。本文选取菌株T2-19进行进一步研究。其16S rRNA基因序列提交至NCBI，登录号为PP770727。该序列使用Ez-Taxon-e服务与近缘模式菌株序列进行比对。选取相似性最高的15株模式菌株，以邻接法构建系统发育树。如图4所示，系统发育树显示菌株T2-19与枯草芽孢杆菌NCIB 3610ᵀ聚为一支。如表1所示，菌株T2-19（SRX24429325）与模式菌株枯草芽孢杆菌ATCC 6051（GCA_000344745.1）的ANI、dDDH和AAI值分别为98.80%、98.69%和89.40%，均高于物种界定阈值ANI（95–96%）、dDDH（95–96%）和AAI（70%）。此外，菌株T2-19与其他芽孢杆菌属相关模式菌株的ANI、dDDH和AAI值均低于物种界定阈值。以上结果表明菌株T2-19属于枯草芽孢杆菌。
【数据】16S rRNA登录号：PP770727；T2-19与B. subtilis ATCC 6051的ANI：98.80%；dDDH：98.69%；AAI：89.40%；ANI阈值：95–96%；dDDH阈值：95–96%；AAI阈值：70%
3.4 接种细菌数量对菌丝生长的影响
为研究接种细菌数量对菌丝生长的影响，制备了不同浓度的T2-19悬液。每支试管共接种100 μl细菌悬液和直径8 mm的皱环球盖菇菌丝圆片，在25°C黑暗条件下培养16天以测定菌丝生长速率。如图5所示，接种体积为100 μL、浓度从1.2 × 10⁶ cfu/ml到1.2 × 10¹⁰ cfu/ml的五个处理均对菌丝生长有显著促进作用。接种浓度为1.2 × 10⁹ cfu/ml的处理生长速率最快，为3.23 mm/d，比对照的2.21 mm/d高46%。以该处理为参照，减少或增加枯草芽孢杆菌接种量均会降低细菌对皱环球盖菇菌丝生长的促进作用。这表明除菌株外，接种数量也显著影响对皱环球盖菇菌丝生长的促进效果。最佳接种量相对较高。即使接种最佳量枯草芽孢杆菌的处理，其菌丝生长速率（3.23 mm/d）仍慢于不完全灭菌木屑培养基中的生长速率（4.19 mm/d–4.92 mm/d）（图5）。
【数据】接种体积：100 μL；浓度范围：1.2 × 10⁶–1.2 × 10¹⁰ cfu/ml；最佳浓度：1.2 × 10⁹ cfu/ml；最佳生长速率：3.23 mm/d；对照生长速率：2.21 mm/d；提升幅度：46%；不完全灭菌基质生长速率：4.19–4.92 mm/d；培养温度：25°C；培养时间：16天
3.5 热灭活枯草芽孢杆菌对菌丝生长的影响
如表2所示，对照组和热灭活组的菌丝生长速率分别为2.17和2.12，两者之间无显著差异（p > 0.05）。该结果表明枯草芽孢杆菌对菌丝生长的促进作用并非归因于死细菌细胞残留成分的物理干扰。
【数据】对照组生长速率：2.17；热灭活组生长速率：2.12；差异显著性：p > 0.05
3.6 基质中芽孢杆菌存活与增殖的评估
为评估不同接种浓度下芽孢杆菌在基质中的存活和增殖能力，设置了五个浓度梯度（1.2 × 10⁶、1.2 × 10⁷、1.2 × 10⁸、1.2 × 10⁹和1.2 × 10¹⁰ cfu/mL），并在接种后第0、1、3、5、7、14、21和28天测定活菌数。结果见表3。在基质中，1.2 × 10⁶和1.2 × 10⁷ cfu/mL组的芽孢杆菌活菌数在第7天显著增加（分别约为9.3倍和5.2倍，p < 0.05），表明该菌株能利用基质中的营养物质主动增殖。在1.2 × 10⁸、1.2 × 10⁹和1.2 × 10¹⁰ cfu/mL组中，虽未观察到显著增殖，但活菌数在28天内保持稳定（高浓度组仍维持初始水平的>85%），表明该菌株具有长期自我维持能力。空白对照中未检测到菌落。
【数据】浓度梯度：1.2 × 10⁶、1.2 × 10⁷、1.2 × 10⁸、1.2 × 10⁹、1.2 × 10¹⁰ cfu/mL；取样时间点：0、1、3、5、7、14、21、28天；1.2 × 10⁶组第7天增殖：约9.3倍；1.2 × 10⁷组第7天增殖：约5.2倍；显著性：p < 0.05；高浓度组28天维持：>85%；空白对照：未检测到菌落
3.7 菌丝介导的细菌迁移
由于水膜的不连续性，细菌在水不饱和基质中的移动和扩散受到限制。能够在水不饱和基质中作为运动细菌扩散载体的真菌菌丝被称为真菌高速公路。从被皱环球盖菇定殖的试管木屑培养基顶部和底部取样检测枯草芽孢杆菌。在仅接种枯草芽孢杆菌的木屑培养基中，枯草芽孢杆菌仅在顶部检测到，底部未检测到。在枯草芽孢杆菌和皱环球盖菇共接种的木屑培养基中，枯草芽孢杆菌不仅在顶部检测到，在底部也能检测到。最初接种在木屑培养基表面的100 μL细菌悬液浓度从10⁶ cfu/ml到10¹⁰ cfu/ml不等，而底部检测到的细菌含量一致，为（5.25 ± 2.11）× 10⁶ cfu/g（鲜重）。这表明枯草芽孢杆菌不仅能随皱环球盖菇菌丝生长而生长和增殖，还能利用皱环球盖菇菌丝作为真菌高速公路在木屑培养基中长距离扩散。
【数据】初始接种浓度范围：10⁶–10¹⁰ cfu/ml；接种量：100 μL；底部检测细菌含量：（5.25 ± 2.11）× 10⁶ cfu/g（鲜重）；仅接种细菌组：底部未检测到；共接种组：底部检测到
3.8 木质纤维素酶活性
本文中用于制备培养基的原料为杨树木屑，其主要成分为木质纤维素……
【数据】培养基原料：杨树木屑；主要成分：木质纤维素；原文未详述具体酶活数值
讨论与解读
皱环球盖菇是一种重要的商业化栽培食用菌。然而，使用完全灭菌基质制备菌种时，菌丝生长缓慢甚至完全不生长，已成为皱环球盖菇生产中的瓶颈问题。本研究发现，皱环球盖菇在未灭菌或不完全灭菌木屑培养基中的菌丝生长速率比完全灭菌木屑培养基提高了90%–125%。从被皱环球盖菇定殖且无微生物污染症状的基质中分离到大量枯草芽孢杆菌。在完全灭菌木屑培养基上，接种枯草芽孢杆菌可使皱环球盖菇菌丝生长速率比未接种对照提高8.63%–46.82%。这表明枯草芽孢杆菌对皱环球盖菇菌丝生长具有促进作用。木质纤维素的降解能力是影响食用菌菌丝生长的重要因素。银耳不能有效降解纤维素或木质素，只有在伴生菌香灰菌存在时才能形成子实体，后者在木质素和碳水化合物降解方面表现极为优异，为银耳生长发育提供营养。
编译者解读
该研究揭示了一个被忽视的合成生物学应用场景：食用菌菌种制备中的“微生物伴侣”问题。作者用经典微生物学方法锁定枯草芽孢杆菌T2-19这一关键促生菌，并证实其通过真菌高速公路在基质中定殖。但从合成生物学视角看，研究尚未阐明促生的分子机制——酶活变化无法解释表型，热灭活实验排除了物理干扰，真正的信号通路或代谢互作仍是黑箱。未来若能将T2-19改造为可控分泌木质素降解酶或生长因子的工程菌株，或许能突破皱环球盖菇菌种制备的效率瓶颈。
参考来源
期刊：Fungal Biology, 2026
DOI: 10.1016/j.funbio.2026.101834
DOI: 10.1016/j.funbio.2026.101834