来源：Isolation and identification of Bacillus subtilis and Pseudomonas fluorescens bacteria from cotton plant (Gossypium hirsutum) rhizospheric soil and potential use as food waste decomposer（Next Sustainability）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
餐厨垃圾的累积与处置带来的环境问题日益严峻，寻找可持续的生物降解方案成为研究热点。本研究从印度拉贾斯坦邦Kotputli–Behror地区棉花（Gossypium hirsutum）根际土壤中采集30份样品，经稀释涂布、选择性培养基分离及形态学、生化与显微分析，鉴定出枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）。将两株菌单独及以1:1 consortium形式接种于餐厨垃圾，监测温度、pH、电导率、磷、氮、钾及C/N比等指标。结果表明，含双菌 consortium 的容器3降解效率最高，四週后转化为营养丰富的生物肥料。该研究为餐厨垃圾的资源化处理提供了一条经济、环保的微生物学路径。
研究背景
根际土壤中栖息着大量微生物，它们既影响餐厨垃圾的分解过程，也调节土壤的理化性质。淀粉酶可分解复杂碳水化合物；根瘤菌、亚硝化单胞菌、假单胞菌和硫杆菌等细菌群落参与养分循环，并产生抗生素、酶类及多种初级和次级代谢产物。餐厨垃圾已成为城市、机构、学校、医院和食堂面临的突出问题，管理不善导致环境持续污染。全球每年约损失13亿吨食物。医院、大学、工厂、学院和学校等场所较易实施餐厨垃圾管控。芽孢杆菌和黃单胞菌属有助于减少餐厨垃圾，芽孢杆菌属可在典型餐厨垃圾混合物中的高温下旺盛生长，从而显著降低其固体含量，其中枯草芽孢杆菌对固体含量的降幅最大。堆肥和生物分解是将餐厨垃圾转化为有机肥料的有效方法之一。本研究即考察枯草芽孢杆菌在工业、生物材料和农业应用中的进展——这些细菌通过酶活性在各类物质分解中发挥关键作用。
研究方法
2.1 枯草芽孢杆菌与荧光假单胞菌的生态学背景
根际，即植物根系周围的土壤，可被枯草芽孢杆菌有效定殖。它通过分泌脂肽和抗生素抑制植物病原菌；通过提高酶活性（过氧化氢酶、脲酶、磷酸酶和蛋白酶）并支持氮循环来改善土壤质量。枯草芽孢杆菌有助于修复被金属污染的土壤，并帮助植物抵御干旱、高温和高盐等胁迫。它能够产生抗紫外线、耐热和耐严重干燥的内生孢子；能在多种土壤类型和氧气浓度下生长；并形成复杂的生物膜以耐受营养匮乏或高胁迫条件。与土壤生态系统的相互作用有助于分解土壤有机质，产生生长素和其他促进根系生长的植物激素，并提高根际细菌种群的多样性，尤其是在盐碱或退化土壤中。
土壤中的生态意义——根际，即植物根系周围区域，是荧光假单胞菌优先定殖的场所。由于其高度的移动性和利用根系分泌物中多种碳源的能力，它能迅速在根表面定殖。养分循环和植物生长促进（PGPR）显著影响氮循环和碳循环。作为生物防治剂，它们产生抗真菌代谢物，保护植物免受土传病原体（包括细菌、线虫和真菌）的侵害。它们通过产生胞外聚合物（EPS）来增强自身存活能力和抵御环境胁迫的能力，EPS使得在根表面形成生物膜成为可能。它们可以分解污染土壤中的毒素，包括碳氢化合物和农药残留。
关于环境适应与栖息地，尽管荧光假单胞菌菌株是需氧菌，但在氧气稀缺时可以利用硝酸盐作为替代电子受体。尽管荧光假单胞菌在全球分布，但研究表明某些菌株表现出高度的地点特有性，具有适应当地条件的独特基因型。在较深的土壤层中，它们可能处于休眠或“活的但不可培养”（VBNC）状态，这种状态使它们能够耐受恶劣环境。它们与土壤无脊椎动物相互作用；例如，荧光假单胞菌利用蚯蚓通道作为生存场所。
【数据】菌株：Bacillus subtilis、Pseudomonas fluorescens；环境因子：紫外线、热、干燥、干旱、高温、高盐、盐碱、缺氧；代谢产物：脂肽、抗生素、过氧化氢酶、脲酶、磷酸酶、蛋白酶、生长素、EPS、抗真菌代谢物；原文未详述具体浓度与温度数值
2.2 土壤样品采集及枯草芽孢杆菌与荧光假单胞菌的分离鉴定
在印度拉贾斯坦邦Kotputli–Behror地区（海拔771.1 m，纬度27.6690407° N），从棉花（Gossypium hirsutum）根际土壤中采集30份土壤样品，置于非透明、无菌的封口袋中，如图1(a,b,c)所示。从Gossypium hirsutum根际土壤中分离出两株细菌：(a) 枯草芽孢杆菌和(b) 荧光假单胞菌，来自三组样品，每组含10份土壤样品[22]。
【数据】样品数：30份；地点：印度拉贾斯坦邦Kotputli–Behror；海拔：771.1 m；纬度：27.6690407° N；分组：3组×10份；菌株：Bacillus subtilis、Pseudomonas fluorescens
2.3 用于分离细菌的倾注平板技术
用天平称取10克土壤样品后，将样品转移至含90毫升无菌蒸馏水的螺口玻璃瓶中并涡旋。使用无菌移液管，将1 ml原始悬浮液加入两个无菌培养皿中的每一个。为进行进一步系列稀释，将1 ml初始样品转移至含9 ml无菌蒸馏水的试管中。每个十进制稀释使用新的无菌微量移液器吸头，重复该过程直至第八次稀释。从三十份土壤样品中，分别向每个培养皿中倒入15 ml 45°C的胰蛋白胨大豆琼脂[Himedia M290]。通过顺时针和逆时针旋转培养皿，轻轻混合接种物和培养基。待混合物完全凝固后，将培养皿倒置，在30°C下培养24小时。
【数据】土壤样品：10 g；无菌蒸馏水：90 ml；初始悬浮液：1 ml；系列稀释：1 ml + 9 ml，至第八次稀释；培养基：胰蛋白胨大豆琼脂（Himedia M290）；培养基温度：45°C；每皿用量：15 ml；培养温度：30°C；培养时间：24 h；培养皿数：30份样品各一皿
2.4 分离细菌的鉴定
#### 2.4.1 革兰氏染色
从平板计数琼脂培养皿上挑取菌落，与一滴无菌蒸馏水混合，在洁净载玻片上制成薄涂片。涂片自然风干，然后通过短暂通过火焰进行热固定。用几滴结晶紫（初染剂）染色，静置60秒，然后用自来水冲洗。将革兰氏碘液施加于涂片60秒并冲洗，随后用95%乙醇脱色10秒。用番红复染一分钟，用纯化水冲洗，自然风干。制备的载玻片在显微镜下检查。
【数据】初染：结晶紫，60 s；媒染：革兰氏碘液，60 s；脱色：95%乙醇，10 s；复染：番红，1 min；干燥方式：自然风干；原文未详述显微镜型号与放大倍数
2.5 用于细菌分离的选择性培养基及生化试验
使用十六烷基三甲基溴化铵琼脂培养基分离和鉴定荧光假单胞菌。使用甘露醇多粘菌素琼脂（MYP）分离和鉴定枯草芽孢杆菌。细菌鉴定采用运动性、过氧化氢酶、氧化酶、脲酶、硝酸盐还原、吲哚、Voges–Proskauer和柠檬酸盐利用试验。
【数据】选择性培养基：十六烷基三甲基溴化铵琼脂（荧光假单胞菌）、甘露醇多粘菌素琼脂MYP（枯草芽孢杆菌）；生化试验：运动性、过氧化氢酶、氧化酶、脲酶、硝酸盐还原、吲哚、Voges–Proskauer、柠檬酸盐利用，共8项；原文未详述各试验试剂浓度与温度
2.6 样品制备与餐厨垃圾分解活性测试程序
我们制备了70%甘油，加入营养肉汤，并对混合物进行高压灭菌。将细菌培养物与0.5 ml 70%甘油混合，在−22°C下长期保存（例如两年）。餐厨垃圾采集自印度斋浦尔拉贾斯坦大学食堂区域。全麦面饼、茶包、蔬菜、大蒜、沙拉、果皮、香蕉和苹果等各类废弃物被收集在四个容器中，并运至实验室进行测试。将收集的材料在阳光下摊晒一天以去除多余水分后，每个容器的内容物被仔细混合并切碎成小块[23]。收集的餐厨垃圾容器标记如下：容器1 – 枯草芽孢杆菌，容器2 – 荧光假单胞菌，容器3 – 荧光假单胞菌与枯草芽孢杆菌的混合物（1:1），容器4 – 标记为不加细菌用于结果比较。每个标记容器含有相应的细菌处理用于测试样品。分析餐厨垃圾样品的参数包括温度、pH、电导率、钾、氮、C/N比和磷。
【数据】甘油浓度：70%；甘油用量：0.5 ml；保存温度：−22°C；保存时间：例如两年；餐厨垃圾来源：拉贾斯坦大学食堂；晾晒时间：1天；容器数：4个；容器3菌株比例：1:1；分析参数：温度、pH、电导率、钾、氮、C/N比、磷
2.7 细菌接种与培养
容器1、2和3的中心注射了细菌，而容器4在室温下不加细菌培养。餐厨垃圾的分解活性与对照实验（即不加细菌）进行比较[23]。
【数据】接种容器：1、2、3；对照容器：4（不加细菌）；培养温度：室温；原文未详述接种量与接种时间
2.8 废弃食物样品的关键过程参数分析
水分含量通过将样品在热风烘箱中干燥后称重来测定，通常在105°C下进行。水分含量计算公式为：%水分含量 = (A − B) × 100 / A。其中A为样品的初始重量（湿重），B为样品的最终干重。曝气速率对于维持微生物活性、调节温度和优化氧传递至关重要，是指随时间供给堆肥系统或生物反应器的空气流量。对于餐厨垃圾，0.2–0.3（L min⁻¹ kg⁻¹）干物质的曝气速率是合适的。曝气效果通过氧传递效率（OTE）衡量，OTE量化了相对于所消耗功率的溶解氧量。使用溶解氧（DO）计和曝气泵在每个间隔测量溶解氧。在本研究中，使用实验室规模的混合装置将已减小至约3–4 mm粒径的固体餐厨垃圾均质化。为确保充分混合，使用了工业混合器。为确定粒径分布，对处理后的材料进行分析，使用……
【数据】干燥温度：105°C；水分含量公式：% = (A − B) × 100 / A；曝气速率：0.2–0.3 L min⁻¹ kg⁻¹（干物质）；粒径：约3–4 mm；测量仪器：溶解氧（DO）计、曝气泵、实验室规模混合装置、工业混合器；原文未详述OTE具体数值与粒径分布分析方法
研究结果
3.1 细菌在胰蛋白胨大豆琼脂上的生长
使用胰蛋白胨大豆琼脂接种从Gossypium hirsutum根际土壤中获得的三十株细菌。大多数分离菌株呈白色形态。如图2所示，菌株A、B、C、D和E在30°C下于胰蛋白胨大豆琼脂上生长。
【数据】菌株数：30株；菌株编号：A、B、C、D、E；培养温度：30°C；培养基：胰蛋白胨大豆琼脂；菌落形态：大多数为白色
3.2 分离细菌的培养鉴定
在回收的三十株细菌中，二十五株为革兰氏阳性，五株为革兰氏阴性。除S11（粘液状）和S25（带绿色）外，所有分离菌落均为白色，如表2所示。TSA（胰蛋白胨大豆琼脂）革兰氏染色细菌在显微镜下观察结果见上图。S30分离菌株的革兰氏阳性杆菌如图3(B)所示，而S28分离菌株的革兰氏阴性杆菌如图3(A)所示。
【数据】菌株总数：30株；革兰氏阳性：25株；革兰氏阴性：5株；特殊菌落：S11（粘液状）、S25（带绿色）；其余菌落颜色：白色；菌株S30：革兰氏阳性杆菌；菌株S28：革兰氏阴性杆菌
3.3 生化试验
#### 3.3.1 运动性试验
将制备好的无菌运动性试验培养基（M260, Hi-Media）分装到无菌试管中。使用接种针，每个纯细菌分离株（S1–S30）通过单次穿刺接种到培养基中心，到达试管下半部分。接种的试管在37°C下培养10–24小时。运动性细菌在培养基表面和内部均表现出从穿刺线向外辐射的弥散、伞状生长。基于这些观察，分离株S1至S8、S10、S12、S13、S14、S15、S17、S18、S19、S21、S23、S25、S27、S29和S30显示运动性阳性，如表S1所示。
【数据】培养基：运动性试验培养基（M260, Hi-Media）；接种方式：单次穿刺至试管下半部分；培养温度：37°C；培养时间：10–24 h；阳性菌株：S1–S8、S10、S12、S13、S14、S15、S17、S18、S19、S21、S23、S25、S27、S29、S30；阳性判据：弥散伞状生长
#### 3.3.2 过氧化氢酶试验
将一满环每种细菌菌落转移到洁净载玻片上。当加入一滴3% H₂O₂并轻轻与菌落混合时，立即产生气泡表明过氧化氢酶活性。在五到十秒内释放氧气泡证实过氧化氢酶的存在。所有分离株的观察结果总结在表S1中。基于过氧化氢酶试验，分离株S2–S9、S11、S12、S13、S15、S19、S20、S21、S24、S28、S29和S30被鉴定为过氧化氢酶阳性，如表S1所示，表明过氧化氢被主动分解为水和氧气。
【数据】试剂：3% H₂O₂；阳性判据：5–10 s内产生气泡；阳性菌株：S2–S9、S11、S12、S13、S15、S19、S20、S21、S24、S28、S29、S30
#### 3.3.3 氧化酶试验
将菌落分散并良好分离在氧化酶纸片DD018 Hi-media上。反应在25–30°C下约5–10秒内可观察。阴性反应的纸片在前十秒内保持无色，而阳性反应的纸片则呈现浓郁的紫蓝色。细菌分离株S3、S4、S8、S11、S17、S25、S27和S30显示氧化酶试验阳性结果，如表S1所示。
【数据】试剂：氧化酶纸片DD018 Hi-media；反应温度：25–30°C；反应时间：5–10 s；阳性判据：紫蓝色；阳性菌株：S3、S4、S8、S11、S17、S25、S27、S30
#### 3.3.4 脲酶试验
制备尿素肉汤培养基18（MM111, Hi-Media）并灭菌后分装到试管中。肉汤接种一满环微生物。在37°C下培养24–48小时后显色。所有细菌分离株S1至S30脲酶试验均为阳性，如表S1所示。
【数据】培养基：尿素肉汤培养基18（MM111, Hi-Media）；培养温度：37°C；培养时间：24–48 h；阳性菌株：S1–S30（全部30株）
#### 3.3.5 硝酸盐还原试验
将制备好的、灭菌的硝酸盐肉汤（M439 Hi-Media）接种测试菌。在37°C下培养48小时后，向每支试管中加入五滴α-萘胺和1毫升磺胺酸试剂。试管内容物发生颜色变化。细菌分离株S1、S3、S4、S6、S7、S8、S9、S13、S15、S19、S20、S23、S24、S26、S27和S30的硝酸盐还原试验为阳性，如表S1所示。
【数据】培养基：硝酸盐肉汤（M439 Hi-Media）；培养温度：37°C；培养时间：48 h；试剂：α-萘胺5滴、磺胺酸1 ml；阳性菌株：S1、S3、S4、S6、S7、S8、S9、S13、S15、S19、S20、S23、S24、S26、S27、S30
#### 3.3.6 吲哚试验
含S1至S30细菌分离株的色氨酸肉汤在37°C下培养24小时。培养完成后，加入两到三滴Kovac试剂，轻轻摇动试管；红色环的形成表明吲哚的存在。S1、S2、S5、S6、S7、S9、S12、S16、S17、S20、S21、S23、S28和S29分离株显示吲哚试验阳性结果，如表S1所示。
【数据】培养基：色氨酸肉汤；培养温度：37°C；培养时间：24 h；试剂：Kovac试剂2–3滴；阳性判据：红色环；阳性菌株：S1、S2、S5、S6、S7、S9、S12、S16、S17、S20、S21、S23、S28、S29
#### 3.3.7 Vogues Proskauer试验
按照制造商说明在试管中制备MR/VP肉汤（LQ082 Hi-Media）。然后，将测试菌（S1至S30）的纯分离培养物加入肉汤管中。试管在35°C下培养24小时。培养结束后，将1 ml肉汤转移到无菌试管中。向每支试管中加入总计0.6 ml的5% α-萘酚和0.2 ml的40% KOH。轻轻混合使培养基暴露于环境氧气后，试管静置10–15分钟。阳性反应表现为粉红色显色，而无颜色变化表示阴性反应。根据表S1，S2、S5、S6、S7、S9、S10、S11、S13、S15、S18、S19、S20、S22、S23、S27、S28和S29细菌分离株试验阳性。
【数据】培养基：MR/VP肉汤（LQ082 Hi-Media）；培养温度：35°C；培养时间：24 h；试剂：5% α-萘酚0.6 ml、40% KOH 0.2 ml；静置时间：10–15 min；阳性判据：粉红色；阳性菌株：S2、S5、S6、S7、S9、S10、S11、S13、S15、S18、S19、S20、S22、S23、S27、S28、S29
#### 3.3.8 柠檬酸盐利用试验
从良好分离的菌落中部挑取接种物，划线接种到制备好的Simmons柠檬酸盐培养基斜面上。试管在37°C下培养4–7天。当斜面颜色从绿色变为蓝色时表示阳性结果。根据表S1，S1、S3、S4、S7、S8、S9、S10、S18、S19、S21、S22、S24、S25、S26和S30细菌分离株显示柠檬酸盐利用试验阳性结果。基于生化检查[24]，三个细菌分离株（S13、S15和S19）被确认为枯草芽孢杆菌，而四个细菌分离株（S3、S4、S8和S30）被确认为荧光假单胞菌。基于形态学和生化检查，分离的细菌被确认为枯草芽孢杆菌NCIM 2063（等同于Bacillus spizizenii ATCC 6633）。细菌的形态学和生化分析表明它们是荧光假单胞菌ATCC13525。
【数据】培养基：Simmons柠檬酸盐培养基斜面；培养温度：37°C；培养时间：4–7天；阳性判据：绿色变蓝色；阳性菌株：S1、S3、S4、S7、S8、S9、S10、S18、S19、S21、S22、S24、S25、S26、S30；确认枯草芽孢杆菌：S13、S15、S19；确认荧光假单胞菌：S3、S4、S8、S30；参考菌株：枯草芽孢杆菌NCIM 2063（=Bacillus spizizenii ATCC 6633）、荧光假单胞菌ATCC13525
3.4 控制参数对餐厨垃圾样品的影响
在样品检测的第一天，每个容器中的水分含量（%）几乎相同，范围为65%至66.33%。在所有容器中，两周后水分含量（%）降至61%至62.66%之间。然而，一个显著发现是四週后水分含量显著降至51.66%至53%之间。细菌活动主要通过生物干燥（也称为微生物堆肥）大幅降低餐厨垃圾的水分含量，其中有机物被嗜热细菌分解产生热量，从而蒸发水分。通过增加代谢热输出，这一过程——通常通过曝气增强——可以消除大量水分（约70–80%）。如表3所示，增加餐厨垃圾堆肥中的曝气速率可增强细菌活性并改变微生物群落结构。最佳曝气速率进一步刺激微生物活性，从而加速有机废弃物的分解并改善堆肥质量。与其他容器相比，容器3的总挥发性固体从第一周至第四周下降，这是由于其高食物分解率，如表3所示。
【数据】第1天水分含量：65%–66.33%；第2周水分含量：61%–62.66%；第4周水分含量：51.66%–53%；水分去除率：约70–80%；容器3总挥发性固体：第1周至第4周下降；原文未详述总挥发性固体的具体数值
3.5 枯草芽孢杆菌与荧光假单胞菌的餐厨垃圾分解活性
将枯草芽孢杆菌菌株S13（100 ml接种物）引入容器1，将荧光假单胞菌菌株S30（100 ml接种物）加入容器2。将枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌的consortium（50:50 ml接种物）加入容器3。容器4（不加细菌）用作实验对照（加入100 ml蒸馏水），如图4所示。在开始实验之前，我们从对照实验所用的餐厨垃圾容器（容器4，不加细菌）中采集样品，并在实验室进行分析，如表4所示[25]。餐厨垃圾在容器3中四週后转化为营养丰富的生物肥料。生物肥料可改善生物量和土壤质量[26]。餐厨垃圾的分解通过多种因素进行分析，包括温度、pH、C/N比、氮、钾和磷水平，如表4所示。
【数据】容器1：枯草芽孢杆菌S13，100 ml接种物；容器2：荧光假单胞菌S30，100 ml接种物；容器3：枯草芽孢杆菌+荧光假单胞菌consortium，50:50 ml接种物；容器4：对照，100 ml蒸馏水；分解时间：4周；分析指标：温度、pH、C/N比、氮、钾、磷；原文未详述各指标具体数值
讨论与解读
本研究从棉花根际土壤中采集三十份样品，经生化检查确认其中两株分离株分别为荧光假单胞菌和枯草芽孢杆菌。这些细菌被应用于从拉贾斯坦大学食堂区域收集的餐厨垃圾，通过测量温度、pH、电导率、钾、硝酸盐、磷和C/N比来监测分解速率。枯草芽孢杆菌与荧光假单胞菌以1:1 consortium形式应用于餐厨垃圾容器3，其效果优于容器1和容器2中单独添加的细菌，如图4所示[容器3含枯草芽孢杆菌+荧光假单胞菌（从上往下第三个）]。最终，利用微生物或生物consortium将餐厨垃圾转化为生物肥料。该技术经济且环境友好，可商业应用于解决全球餐厨垃圾处理问题。本研究还可探索酶工程以提高酶在pH、温度、盐度等多种条件下的稳定性和活性；将菌株整合到堆肥机中以加速工业和家庭餐厨垃圾的分解；分析在土壤或堆肥中使用改良菌株对自然生态系统的影响；比较微生物废物分解与传统技术的环境优势；考察……等变量。
编译者解读
该研究走的是“根际筛选—生化鉴定—consortium复配—堆肥验证”的经典路线，方法学上并不复杂，但胜在贴近应用：从棉花根际直接挖掘具有降解功能的芽孢杆菌和假单胞菌，并以1:1复配验证了协同增效。其价值在于为餐厨垃圾就地处理提供了一套低成本、可复制的菌剂方案。局限也明显——鉴定依赖传统生化试验，未做分子鉴定或基因组测序；堆肥验证停留在实验室容器规模，缺乏中试数据；consortium的协同机制（是酶互补还是代谢产物互促）未作解析。若后续引入合成生物学手段对降解酶系进行模块化改造，或构建可控的菌群比例，应用潜力会更大。
参考来源
期刊：Next Sustainability, 2026
DOI: 10.1016/j.nxsust.2026.100394
DOI: 10.1016/j.nxsust.2026.100394