来源：Reconstitution of human milk oligosaccharide biosynthesis in cultured mammalian cells（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
人乳寡糖（HMOs）是母乳中含量第三的固体成分，对婴儿肠道菌群和免疫发育至关重要。但长期以来，常用的哺乳动物培养细胞几乎不具备合成HMOs的能力。本研究通过表达α-乳白蛋白（LALBA）基因，在HEK293细胞中成功重建了HMO生物合成途径，产出包括3′-唾液酸乳糖、2′-岩藻糖基乳糖、LSTa/d及DSLNT在内的多种HMOs。研究者进一步通过调控B4GALT1、B3GNT2、B3GALT5等糖基转移酶基因改变产物组成，并在HCT116和CHO-K1细胞中验证了该策略的普适性。此外，研究还实现了叠氮基团对3′-SL的代谢标记，并证实所产HMOs具有促进双歧杆菌生长的益生元效应。
研究背景
人乳寡糖是母乳中仅次于乳糖和脂质的第三大固体成分，成熟乳中浓度约为5–20 g/L，初乳中可达约22–24 g/L。这类非结合型聚糖由五种单糖单元——葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）、岩藻糖和唾液酸——组合而成。目前已鉴定出超过200种不同的HMO结构，其大小、组成、连接方式及岩藻糖化或唾液酸化程度各异，均基于21种核心骨架结构延伸而来。这些复杂聚糖不能被婴儿胰酶消化，而是作为益生元选择性促进双歧杆菌等有益菌生长，同时充当诱饵受体阻止病原体黏附肠道上皮。
HMOs在乳腺上皮细胞中通过特定糖基转移酶催化的连续糖基化反应合成，但其他细胞类型及常用培养哺乳动物细胞系中几乎观察不到HMO的产生。尽管HMOs在婴儿营养和宿主–微生物互作中具有核心地位，其在乳腺上皮细胞中的生物合成途径尚未被完全阐明。基于基因表达谱、比较基因组学和计算模拟虽已提出候选糖基转移酶，但体内实际运作的精确酶组合、各酶的相对贡献及其在高尔基体中的层级组织仍 largely 未解。在此背景下，在培养细胞中重建HMO合成途径不仅有助于解析其生物合成逻辑，也为建立可规模化的细胞基生产平台提供了可能。
研究方法
细胞培养
HEK293（CRL-1573）、HEK293T（CRL-3216）和CHO-K1（CCL-61）细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），并在实验室常规维持。HCT116细胞（RCB2979）购自RIKEN Bio-Resource Center。HEK293、HEK293T和HCT116细胞维持于高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，补充10%胎牛血清（FBS）。CHO-K1细胞维持于DMEM/Ham's F-12培养基中，补充10% FBS。所有细胞均在37°C、含5% CO₂的湿润空气中培养。
【数据】细胞系：HEK293、HEK293T、CHO-K1、HCT116；培养基：高糖DMEM（HEK293/HEK293T/HCT116）、DMEM/Ham's F-12（CHO-K1）；血清：10% FBS；温度：37°C；CO₂浓度：5%
质粒构建
为构建pME-Hyg-LALBA-3HA，化学合成LALBA基因片段，并使用In-fusion克隆（Takara Bio）将其插入经EcoRI和MluI线性化的pME-Hyg-3HA载体（Liu et al., 2021）中。扩增人B4GALT1基因全长片段，克隆入经BamHI和EcoRI线性化的pcDNA6-mycHisA（Thermo Fisher Scientific）载体，生成pcDNA6-BSD-B4GALT1-mycHis6。扩增人B3GNT2基因全长片段，克隆入经EcoRI和XhoI线性化的pcDNA6-mycHisA载体，生成pcDNA6-BSD-B3GNT2-mycHis6。扩增B3GALT5全长，克隆入pME-puro-3FLAG（Wang et al., 2020）的EcoRI和MluI位点，生成pME-puro-B3GALT5-3FLAG。为合成分泌型B3GNT2（Lys45-Cys397），扩增DNA片段并克隆入pcDNA-IHT载体（Itoh et al., 2026）的EcoRI和EcoRV位点，该载体含有编码小鼠Ig kappa链信号肽、His6标签和烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切割位点的DNA序列。类似地，扩增人B3GNT8（Thr41-Cys397）基因片段并克隆入pcDNA-IHT的EcoRI和EcoRV位点，生成pcDNA-IHT-B3GNT8。人B3GNT3（Trp49-Tyr372）、人B3GNT4（His80-Arg378）、人B3GNT5（Arg72-Ile378）、人B3GNT6（Gln44-Ser384）、人B3GALT1（Ser39-Cys326）、人B3GALT4（Ala69-Ser378）和人B3GALT5（Asn43-Val310）基因片段分别扩增并克隆入pcDNA-IHT的EcoRI和NotI位点，生成pcDNA-IHT-B3GNT3、pcDNA-IHT-B3GNT4、pcDNA-IHT-B3GNT5、pcDNA-IHT-B3GNT6、pcDNA-IHT-B3GALT1、pcDNA-IHT-B3GALT4和pcDNA3.1-IHT-B3GALT5。pcDNA-I-TH含有编码小鼠Ig kappa链信号肽、多克隆位点、TEV蛋白酶切割位点和His6标签的DNA序列。扩增的人B3GALT2（Thr63-His422）基因片段插入pcDNA-I-TH载体的EcoRI和EcoRV位点，生成pcDNA-I-B3GALT2-TH。编码B3GALT1、B3GALT2、B3GALT4、B3GNT3和B3GNT4的DNA片段使用质粒作为模板扩增（Soka University）。所有质粒构建体均通过Sanger测序验证。详细质粒序列可应要求提供。本研究中使用的质粒列于Key Resource Table。
【数据】载体：pME-Hyg-3HA、pcDNA6-mycHisA、pME-puro-3FLAG、pcDNA-IHT、pcDNA-I-TH；限制性内切酶：EcoRI、MluI、BamHI、XhoI、EcoRV、NotI；克隆方法：In-fusion cloning；验证方法：Sanger测序；标签：3HA、mycHis6、3FLAG、His6；信号肽：小鼠Ig kappa链信号肽；蛋白酶切割位点：TEV
转染与稳定细胞系建立
转染使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific）按照制造商说明进行。简言之，细胞在转染前24小时接种于12孔组织培养板，生长至约80%汇合度。每孔将3 μL Lipofectamine 3000、2.0 μg质粒DNA和4 μL P3000试剂稀释于100 μL Opti-MEM I（Thermo Fisher Scientific）中并轻柔混合。转染混合物短暂涡旋后于室温孵育15分钟，然后加入细胞。转染后18小时更换培养基。转染后72小时开始抗生素筛选，将培养基替换为含10 μg/ml杀稻瘟菌素S、400 μg/ml潮霉素B或1 μg/ml嘌呤霉素的选择培养基。细胞在相同抗生素浓度下持续选择维持，直至获得稳定增殖的细胞群体。
【数据】转染试剂：Lipofectamine 3000；质粒DNA量：2.0 μg/孔；P3000试剂：4 μL；Lipofectamine 3000：3 μL；Opti-MEM I：100 μL；细胞汇合度：约80%；孵育温度：室温；孵育时间：15 min；换液时间：转染后18 h；筛选起始：转染后72 h；抗生素：10 μg/ml杀稻瘟菌素S、400 μg/ml潮霉素B、1 μg/ml嘌呤霉素
免疫印迹
将约1 × 10⁶细胞培养于6孔板中，收获后用PBS洗涤。细胞在冰上于裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl [pH 7.4]、150 mM NaCl、1% TritonX-100、5 mM EDTA）中裂解30分钟，缓冲液补充有蛋白酶抑制剂混合物（Merck）。细胞裂解液离心后收集上清，加入SDS样品缓冲液变性。对于分泌蛋白分析，将细胞接种于6孔板培养至约90%汇合度。然后将培养基替换为2 mL Opti-MEM I，细胞继续培养2天。收集培养上清（100 μL），800 ×g离心3分钟，加入SDS样品缓冲液变性。蛋白样品经SDS–PAGE分离并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。膜用5%脱脂牛奶封闭，与一抗于4°C孵育过夜，随后与适当的HRP偶联二抗于室温孵育1小时。免疫印迹使用的一抗包括：小鼠单克隆抗HA抗体（HA7 [Merck]）、小鼠单克隆HRP偶联抗His标签抗体（J099B12 [BioLegend]）、小鼠单克隆抗Myc标签抗体（My3 [MBL]）和小鼠单克隆抗FLAG M2抗体（M2 [Merck]）。HRP偶联二抗包括抗兔IgG HRP偶联抗体（Cell Signaling Technology）和抗小鼠IgG HRP偶联抗体（Cell Signaling Technology）。免疫反应信号使用Chemi-Lumi One HRP底物（Nacalai Tesque）检测，图像使用iBright 1500成像系统（Thermo Fisher Scientific）获取。
【数据】细胞数：约1 × 10⁶；裂解缓冲液：50 mM Tris-HCl [pH 7.4]、150 mM NaCl、1% TritonX-100、5 mM EDTA；裂解时间：30 min；裂解温度：冰上；封闭液：5%脱脂牛奶；一抗孵育：4°C过夜；二抗孵育：室温1 h；分泌蛋白收集：100 μL上清；离心：800 ×g、3 min；检测底物：Chemi-Lumi One HRP；成像系统：iBright 1500
LALBA的糖基化分析
对于Endo H和PNGase F消化，细胞在含50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、1% Triton X-100、1 mM EDTA和蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液中裂解。细胞裂解液在SDS样品缓冲液中于95°C变性5分钟。取变性裂解液等分试样，分别与Endo Hf或PNGase F（New England Biolabs）在GlycoBuffer 3或GlycoBuffer 2中孵育。对于Endo Hf和PNGase F处理，按照制造商说明在反应混合物中加入1% NP-40。对照样品平行处理，仅以蒸馏水代替酶。37°C孵育1小时后，样品与4 μL SDS样品缓冲液混合，95°C加热5分钟，20,000 ×g离心1分钟，经SDS-PAGE和Western blotting分析。
【数据】裂解缓冲液：50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、1% Triton X-100、1 mM EDTA；变性温度：95°C；变性时间：5 min；酶：Endo Hf、PNGase F；缓冲液：GlycoBuffer 3、GlycoBuffer 2；NP-40浓度：1%；孵育温度：37°C；孵育时间：1 h；离心：20,000 ×g、1 min
免疫共沉淀
对于免疫共沉淀，细胞在含50 mM MES-NaOH（pH 6.25）、150 mM NaCl、1 mM CaCl₂、1%洋地黄皂苷和蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中裂解。细胞裂解液于4°C、20,000 ×g离心15分钟澄清，上清与Myc-Trap 2.0琼脂糖珠（Proteintech）按照制造商说明孵育。用裂解缓冲液洗涤四次后，结合蛋白用SDS样品缓冲液洗脱，经SDS-PAGE后进行Western blotting。
【数据】裂解缓冲液：50 mM MES-NaOH（pH 6.25）、150 mM NaCl、1 mM CaCl₂、1%洋地黄皂苷；离心：20,000 ×g、15 min、4°C；珠子：Myc-Trap 2.0琼脂糖珠；洗涤次数：4次；洗脱液：SDS样品缓冲液
免疫荧光显微镜
对于免疫荧光显微镜分析，细胞在多聚-L-赖氨酸溶液包被的玻璃盖玻片上培养2天。细胞用4%多聚甲醛的PBS溶液于室温固定20分钟（Ren et al., 2025）。PBS洗涤后，残留醛基通过室温下与40 mM氯化铵的PBS溶液孵育10分钟淬灭。细胞再用PBS洗涤两次。固定后，细胞用封闭液（0.1%皂苷、1%牛血清白蛋白（BSA）、0.1% NaN₃的PBS溶液）于室温透化1小时。细胞与封闭液稀释的一抗于室温孵育1小时，用封闭液洗涤三次。使用的一抗为：小鼠抗HA（HA7 [Merck]；1:500）、兔抗RCAS1（D2B6N [Cell Signaling Technology]；1:100）、兔抗ERp72（D70D12 [Cell Signaling Technology]；1:……）
【数据】培养时间：2天；固定液：4%多聚甲醛；固定温度：室温；固定时间：20 min；淬灭液：40 mM氯化铵；淬灭时间：10 min；透化液：0.1%皂苷、1% BSA、0.1% NaN₃；透化时间：1 h；一抗孵育：室温1 h；抗体稀释：抗HA 1:500、抗RCAS1 1:100、抗ERp72 1:（原文未详述）
研究结果
HEK293细胞中HMO生物合成限速步骤的鉴定
HEK293细胞是一种广泛使用的哺乳动物培养细胞系（Narimatsu et al., 2019; Stepanenko and Dmitrenko, 2015），其内在合成HMOs的能力极低。为探究其原因，我们首先使用GlycoMaple——一种糖代谢途径预测工具——推断了HEK293细胞中的HMO生物合成途径（Supplementary Fig. S1A）（Huang et al., 2021; Kong and Fujita, 2025）。当用GlycoMaple分析HEK293细胞的RNA-seq表达谱时，HMO合成的起始步骤——即由葡萄糖和UDP-半乳糖形成乳糖——被预测为限速步骤（图1A）。已知乳糖合成由β1,4-半乳糖基转移酶B4GALT1和调节亚基LALBA组成的复合物完成（Hill and Brew, 1975; Ramakrishnan and Qasba, 2001）。在HEK293细胞中，B4GALT1表达水平充足，而LALBA表达完全缺失（图1B）。在此起始步骤之后，下游HMO生物合成理论上可由细胞内源性糖基转移酶完成（Supplementary Fig. S1B）。综上，这些发现表明LALBA表达的缺失是阻止HEK293细胞有效产生HMO的关键限制因素。
为克服已鉴定的瓶颈，我们接下来尝试在HEK293细胞中表达LALBA。由于LALBA含有进入分泌途径所需的N端信号肽，我们构建了C端HA标签版本的LALBA基因，以避免影响信号肽依赖的靶向和加工。该构建体通过转染导入HEK293细胞。通过潮霉素筛选建立稳定细胞系。HA标签的LALBA（LALBA-3HA）蛋白在HEK293细胞中强效表达（图1C）。免疫印迹检测到至少三条条带。据报道，LALBA含有一个经典N-糖基化位点和一个具有Asn-Ile-Cys序列的非典型潜在N-糖基化位点（Giuffrida et al., 1997）。使用EndoH或PNGaseF去糖基化处理后这些条带合并为单一条带，表明多条带主要代表LALBA的不同糖基化状态（图S2）。为检查其亚细胞定位，我们使用抗HA抗体进行免疫荧光染色。信号显示与高尔基体标记物强烈共定位（图1D–F及G），与内质网（ER）标记物部分重叠（图1E、F及G）。此外，LALBA-3HA被分泌到培养基中（图1H）。这一观察与LALBA是母乳主要蛋白成分之一的事实一致（Lonnerdal, 2003）。这些结果表明，部分LALBA定位于高尔基体，其余则沿分泌途径释放到细胞外环境。
【数据】细胞系：HEK293；预测工具：GlycoMaple；限速步骤：乳糖合成；B4GALT1表达：充足；LALBA表达：完全缺失；标签：C端3HA；筛选抗生素：潮霉素；免疫印迹条带数：至少3条；去糖基化酶：EndoH、PNGaseF；共定位：高尔基体（强）、内质网（部分）；分泌：是
LALBA表达使HEK293细胞具备HMO生物合成能力
随后我们测试了这些表达LALBA的HEK293细胞是否能合成HMOs。细胞培养后收集培养上清。为去除培养基中的葡萄糖，上清用葡萄糖氧化酶处理（Furukawa et al., 2015）。随后从培养上清中捕获聚糖，用普鲁卡因胺（ProA）标记，并使用液相色谱–电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析。当我们分析表达LALBA的HEK293细胞的条件培养基时，检测到几个在缺乏LALBA表达的对照细胞中不存在的新的聚糖峰（图2A）。为确认这些聚糖的身份，我们进行了MS/MS分析。这些峰的质谱分析揭示了对应于Hex2（m/z 562 [M+H]⁺）、Hex2+dHex（m/z 708 [M+H]⁺）、Hex2+Neu5Ac（m/z 853 [M+H]⁺）、Hex3+HexNAc + Neu5Ac（m/z 609²⁺ [M+2H]²⁺或628²⁺ [M + H + K]²⁺）和Hex3+HexNAc + Neu5Ac2（m/z 755²⁺ [M+2H]²⁺或774 [M + H + K]²⁺）的聚糖组成（图2B和C）。对应于Hex2（m/z 562 [M+H]⁺）的碎片离子根据其保留时间、质量和碎裂模式被鉴定为带有ProA的乳糖。值得注意的是，该碎片在所有检测到的HMOs的MS/MS谱图中一致出现，表明这些结构均从乳糖核心延伸而来。
为进一步表征这些结构，我们进行了顺序酶消化。使用α2,3特异性唾液酸酶以及切割α2,3/α2,6/α2,8连接的非特异性唾液酸酶处理，显示大部分Hex2+Neu5Ac（m/z 853 [M+H]⁺）被α2,3特异性唾液酸酶转化为Hex2（m/z 562 [M+H]⁺）乳糖，表明主要种类为3′-唾液酸乳糖（3′-SL：Neu5Ac-α2,3-Gal-β1,4-Glc）（Supplementary Fig. S3A）。接下来，我们通过结合α2,3-唾液酸酶与β1,3-半乳糖苷酶或β1,4-半乳糖苷酶分析了Hex3+HexNAc + Neu5Ac（m/z 609²⁺ [M+2H]²⁺或628²⁺ [M + H + K]²⁺）的结构。Hex3+HexNAc + Neu5Ac种类在α2,3-唾液酸酶处理后失去一个Neu5Ac，转化为两个与Hex3+HexNAc（m/z 927 [M+H]⁺）一致的峰。基于标准HMOs分析，乳糖-N-四糖（LNT）比乳糖-N-新四糖（LNnT）更早洗脱（Supplementary Fig. S3B）。此外，后一个峰对β1,3-半乳糖苷酶抗性但对β1,4-半乳糖苷酶敏感，表明第一个次要峰为LNT，第二个主要峰为LNnT。因此，Hex3+HexNAc + Neu5Ac（m/z 609²⁺ [M+2H]²⁺或628²⁺ [M + H + K]²⁺）的主要结构应为唾液酸乳糖-N-四糖d（LSTd：Neu5Ac-α2,3-Gal-β1,4-GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc），其含有II型LacNAc（Gal-β1,4-GlcNAc）结构（Supplementary Fig. S4A），而唾液酸乳糖-N-四糖a（LSTa：Neu5Ac-α2,3-Gal-β1,3-GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc）也作为次要结构被检测到（Supplementary Fig. S4A和B）。相比之下，Hex3+HexNAc + Neu5Ac2（m/z 755²⁺ [M+2H]²⁺或774²⁺ [M + H + K]²⁺）在α2,3-唾液酸酶处理后也失去一个Neu5Ac，产生对应于Hex3+HexNAc + Neu5Ac的结构。然而，该产物比LSTd/LSTa稍晚洗脱，提示该结构为LSTb（Supplementary Fig. S3B，右图），其被β1,3-半乳糖苷酶部分消化，但不被β1,4-半乳糖苷酶消化，产生Hex2+HexNAc + Neu5Ac（m/z 1056 [M+H]⁺）（Supplementary Fig. S5A）。这些结果表明该结构含有I型LacNAc（Gal-β1,3-GlcNAc）。因此，原始Hex3+HexNAc + Neu5Ac2（m/z 755²⁺ [M+2H]²⁺或774²⁺ [M + H + K]²⁺）种类应代表二唾液酸乳糖-N-四糖（DSLNT：Neu5Ac-α2,3-Gal-β1,3-(Neu5Ac-α2,6-)GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc）（Supplementary Fig. S5A）。在分析m/z 609²⁺ [M+2H]²⁺碎片时，我们观察到比LSTd保留时间更长的额外峰（Supplementary Fig. S3B，右图）。该峰可被α2,3/6/8-唾液酸酶切割，但对α2,3-唾液酸酶抗性，表明该结构可能为唾液酸乳糖-N-四糖c（LSTc：Neu5Ac-α2,6-Gal-β1,4-GlcNAc-β1,3-Gal-β1,4-Glc）。最后，Hex2+dHex（m/z 708 [M+H]⁺）聚糖被α1,2-岩藻糖苷酶消化，但不被α1,3/4-岩藻糖苷酶消化，确认其为2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL：Fuc-α1,2-Gal-β1,4-Glc）（Supplementary Fig. S5B）。综上，这些结果表明HEK293细胞中LALBA的表达使得至少八种不同HMOs的生物合成成为可能：2′-FL、3′-SL、LNnT、LNT、LSTd、LSTa、LSTc和DSLNT。虽未提供绝对定量，但ProA标记聚糖的质谱强度允许对HMOs的相对丰度进行半定量估计（图2D）。在检测到的种类中，3′-SL最为主要，约占总HMO信号的84.8% ± 5.9%（平均值 ± 标准差）。使用麦芽六糖作为内标，我们估计了……
【数据】葡萄糖去除：葡萄糖氧化酶；标记物：普鲁卡因胺（ProA）；分析：LC-ESI-MS/MS；检测聚糖组成：Hex2（m/z 562）、Hex2+dHex（m/z 708）、Hex2+Neu5Ac（m/z 853）、Hex3+HexNAc+Neu5Ac（m/z 609²⁺/628²⁺）、Hex3+HexNAc+Neu5Ac2（m/z 755²⁺/774²⁺）；鉴定HMO种类：2′-FL、3′-SL、LNnT、LNT、LSTd、LSTa、LSTc、DSLNT；3′-SL占比：84.8% ± 5.9%；内标：麦芽六糖
B4GALT1表达对HMO生物合成的影响
LALBA表达HCT116和CHO-K1细胞中的HMO生产
通过B3GNT2和B3GALT5表达工程化HMO生产细胞
HEK293细胞产生的HMOs的功能标记
HEK293产生的HMOs的益生元效应
讨论与解读
本研究通过表达LALBA基因并结合靶向糖工程策略，成功在哺乳动物培养细胞中重建了HMO生物合成（图7D）。该方法能够生产结构多样的HMOs，包括2′-FL、3′-SL、LNT、LNnT、LSTd、LSTa、LSTc和DSLNT，其中多种是人乳的关键生物活性成分（Dinleyici et al., 2023）。通过系统修饰糖基化途径和代谢环境，研究展示了调节HMO组成和复杂度的能力。这些发现不仅为可规模化的细胞基HMO生产平台奠定了基础，也为实验解析HMO生物合成逻辑提供了工具——这一逻辑在乳腺上皮细胞中仍未被完全理解。
尽管HMOs在婴儿营养和宿主–微生物互作中具有核心重要性（Ambalavanan et al., 2024; Donovan et al., 2012），其在乳腺上皮细胞中产生的生物合成途径尚未被完全阐明。虽然基于基因表达谱、比较基因组学和计算模拟已提出参与HMO合成的候选糖基转移酶，但体内实际运作的精确酶组合（Bao et al., 2021; Kellman et al., 2022; Nyquist et al., 2025）、其相对贡献以及在高尔基体中的层级组织仍 largely 未解。在此背景下，在培养细胞中重建HMO合成途径……
编译者解读
该研究以LALBA为单一关键开关，在HEK293等常用细胞系中激活了原本沉默的HMO合成通路，策略简洁而高效。通过叠加B4GALT1、B3GNT2、B3GALT5等糖基转移酶，实现了产物从简单到复杂的可调控制，展示了合成生物学"底盘细胞+模块化酶"思路在糖工程中的潜力。叠氮糖代谢标记和益生元验证进一步拓展了应用场景。局限在于目前依赖血清培养和质谱半定量，产量与均一性距工业化尚有距离，且乳腺上皮细胞中天然HMO合成调控网络仍待解析。
参考来源
期刊：Metabolic Engineering, 2026
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102494
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102494