来源：High-level surfactin production by Bacillus subtilis through integrated metabolic engineering and bioprocess optimization（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
表面活性素（surfactin）是芽孢杆菌属产生的环状脂肽生物表面活性剂，有望替代石油基表面活性剂。然而天然菌株产量低、前体供应不足、发酵条件不理想等问题制约了其高效生产。本研究以携带完整内源 sfp 基因的枯草芽孢杆菌 ATCC 6051a 为出发菌株，通过多层级代谢工程改造与发酵优化，在 5 L 补料分批生物反应器中 27 小时内实现 52.32 g/L 的表面活性素产量，平均生产强度达 1.94 g/L/h。
研究背景
表面活性素是由芽孢杆菌属产生的两亲性环状脂肽，由七肽环与 β-羟基脂肪酸酰基链连接而成。其经典肽序列为 L-Glu¹-L-Leu²-D-Leu³-L-Val⁴-L-Asp⁵-D-Leu⁶-L-Leu⁷，脂质部分通常含 12–15 个碳原子，最多可延伸至 C19。作为两亲性表面活性剂，表面活性素在浓度超过临界胶束浓度时会发生界面吸附并自组装形成胶束聚集体。它能在较低浓度下显著降低水的表面张力，并对多种疏水物质表现出强乳化活性。例如，枯草芽孢杆菌 50499 产生的表面活性素在临界胶束浓度 20 mg/L 时可将水的表面张力降至 28.6 mN/m，对正己烷、玉米油和原油的乳化指数均超过 90%。这些特性赋予其强发泡、乳化、疏水表面修饰和金属螯合能力，为其在多个生物技术领域的应用提供了基础。在提高石油采收率方面，表面活性素可作为高效生物表面活性剂，通过促进原油驱替和乳化提高石油采收的可持续性。
然而，天然菌株的生产能力有限、前体供应不足以及发酵条件欠优化，仍然制约着表面活性素的高效生产。本研究以 ATCC 6051a 为出发菌株，通过整合菌株工程与发酵优化，构建高效的表面活性素生产体系。
研究方法
2.1 菌株与质粒
本研究所用菌株和质粒列于表 S1。所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司和北京擎科生物科技有限公司合成。DNA 测序服务由擎科生物和上海金开瑞生物提供。亲本菌株枯草芽孢杆菌 ATCC 6051a 购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。用于克隆、DNA 保存、质粒构建和转化的化学感受态大肠杆菌 Top10 细胞购自上海唯地生物技术有限公司。
【数据】菌株：枯草芽孢杆菌 ATCC 6051a、大肠杆菌 Top10；引物合成：生工生物、擎科生物；测序：擎科生物、金开瑞；原文未详述其他具体参数
2.2 遗传操作
如先前所述，枯草芽孢杆菌中的遗传修饰采用 Cre/lox 系统进行。以 codY 基因的删除为例说明操作流程。使用高保真 DNA 聚合酶扩增三个 DNA 片段：codY 的上游同源臂（UcodY）和下游同源臂（DcodY），以及两侧带有 lox 位点的红霉素抗性基因（ermC）。这些片段通过重叠延伸 PCR 组装，生成用于染色体整合的线性双链 DNA 构建体。将预先用 D-木糖诱导的菌株 164T7P 感受态细胞直接用线性 DNA 片段转化。使用 1 μg DNA 转化 0.5 mL 感受态细胞。在 37 ℃ 孵育 2 小时后，将细胞涂布于含红霉素的琼脂平板上，于 37 ℃ 过夜培养。通过菌落 PCR 筛选候选重组菌落。验证正确的克隆随后进行第二轮 D-木糖诱导的感受态发育，并转化 Cre 表达质粒 pMK4-Cre 以去除抗生素标记，获得无标记衍生菌株。所有 DNA 操作均采用标准分子生物学技术。所有酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，并按照制造商方案使用。
【数据】DNA 用量：1 μg；感受态细胞体积：0.5 mL；孵育温度：37 ℃；孵育时间：2 h；过夜培养温度：37 ℃；红霉素浓度：原文未详述（见 2.4 节为 10 μg/mL）；D-木糖诱导浓度：原文未详述（见 2.4 节为 1% w/v）
2.3 质粒构建
本研究用于异源基因表达的质粒基于穿梭载体 pMK4（由 BGSC 提供）。如先前报道，将来源于 pET-28a(+) 的 T7 启动子序列插入 pMK4，得到质粒 pMK4-T7。为将基因盒插入 pMK4-T7，采用了 You 等人开发的"简单克隆"策略。以携带来自大肠杆菌的目标 DNA 片段 pntAB 的质粒 pMK4-T7-EcpntAB 的构建为例：使用高保真 DNA 聚合酶扩增插入片段（EcpntAB）和线性化载体骨架，在其末端引入 50 bp 同源悬臂。随后通过聚合酶链延伸（POE-PCR）将这些片段组装成 DNA 多聚体，直接转化至感受态细胞以获得重组质粒。
【数据】载体：pMK4、pMK4-T7；插入片段：EcpntAB；同源臂长度：50 bp；组装方法：POE-PCR；原文未详述其他具体参数
2.4 培养基与细胞生长
本研究用于菌株构建的培养基为 LB 培养基（5 g/L 酵母提取物，10 g/L 胰蛋白胨，10 g/L NaCl）。固体培养基通过在 LB 培养基中添加 1.5%（w/v）琼脂制备。需要时，抗生素按以下浓度添加：枯草芽孢杆菌使用红霉素（10 μg/mL）或氯霉素（10 μg/mL），大肠杆菌克隆宿主使用氨苄青霉素（100 μg/mL）。为诱导感受态，芽孢杆菌细胞在补充 1%（w/v）D-木糖的 LB 培养基中培养。
【数据】培养基：LB（5 g/L 酵母提取物，10 g/L 胰蛋白胨，10 g/L NaCl）；琼脂：1.5%（w/v）；红霉素：10 μg/mL；氯霉素：10 μg/mL；氨苄青霉素：100 μg/mL；D-木糖：1%（w/v）
2.4.1 摇瓶发酵
将 500 μL 过夜种子培养物接种到 250 mL 锥形瓶中的 50 mL LB 培养基中，于 37 °C、200 rpm 振荡培养至 OD600 达到 2.5–3.0。随后加入 1%（w/v）D-木糖诱导 T7 RNA 聚合酶表达，同时分三批补加 20 g/L 甘油（总浓度 60 g/L）作为碳源。对于碳源优化，将甘油替换为等量的葡萄糖、蔗糖或红糖。对于氮源优化，在含 10 g/L 胰蛋白胨的 LB 培养基中额外补充 10 g/L 的胰蛋白胨、大豆蛋白胨、尿素、硝酸钠、硫酸铵、玉米浆或豆粉。金属离子对表面活性素生产的影响通过分别补充氯化镁或硫酸亚铁作为 Mg²⁺ 和 Fe²⁺ 来源进行评估。氯化镁添加至终浓度 Mg²⁺ 为 100、200、400 和 600 mg/L，硫酸亚铁添加至终浓度 Fe²⁺ 为 100、200、400 和 600 mg/L。未额外补充金属离子的培养基作为对照。为评估摇瓶构型对发酵性能的影响，将 50 mL 培养液分装于不同类型的摇瓶中：250 mL 和 500 mL 标准锥形瓶，以及 250 mL 和 500 mL 挡板摇瓶。对于前体补充，将单个氨基酸（L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸或谷氨酸钠）以 2 g/L 添加到摇瓶中。脂肪酸或脂肪酸前体（大豆油、十六醇、棕榈酸或丙酮酸钠）以 5 g/L 补充。对于使用麦麸作为底物和诱导剂生产表面活性素，实验在 LB 基础培养基中进行。除非另有说明，工作体积为 50 mL。红糖以 20 g/L 的终浓度作为碳源添加，麦麸以 3%（w/v）补充。麦麸作为复合农业残留底物，未经化学预处理。发酵在 500 mL 挡板摇瓶中进行以确保充足的氧传递。所有摇瓶发酵实验均使用三个独立生物学重复。
【数据】种子液体积：500 μL；培养基体积：50 mL；摇瓶体积：250 mL；培养温度：37 °C；转速：200 rpm；OD600：2.5–3.0；D-木糖：1%（w/v）；甘油：20 g/L×3 批（总 60 g/L）；氮源补充：10 g/L；Mg²⁺ 浓度：100、200、400、600 mg/L；Fe²⁺ 浓度：100、200、400、600 mg/L；氨基酸补充：2 g/L；脂肪酸/前体补充：5 g/L；红糖：20 g/L；麦麸：3%（w/v）；生物学重复：3
2.4.2 补料分批发酵
对于 5 L 规模生物反应器培养，将冻存管中的细菌储备液划线接种于 LB 琼脂平板，于 37 ℃ 培养 16 小时。挑取单菌落接种到试管中的 3 mL LB 培养基中，于 37 ℃ 过夜培养。随后将 3 mL 预培养物转移到 100 mL LB 培养基中，于 37 ℃、200 rpm 培养 8 小时。将全部培养物作为接种物接种到含 2.2 L 发酵培养基的 5 L 生物反应器中。接种并充分混合后，发酵液初始 OD₆₀₀ 为 14.80。生物反应器（上海保兴生物设备工程有限公司）配备 pH、溶解氧（DO）和温度探头用于实时监测。混合系统由六叶 Rushton 搅拌桨组成，转速可调（0–800 rpm）。发酵培养基基于摇瓶优化结果配制，提高了 Mg²⁺ 和磷酸盐浓度以增强细菌生长和代谢。最终培养基组成为：红糖 20 g/L、胰蛋白胨 30 g/L、谷氨酸钠 10 g/L、硫酸镁 0.4 g/L、硫酸亚铁 0.2 g/L、磷酸氢二钠 7.5 g/L、磷酸二氢钾 2.5 g/L。pH 通过添加饱和氨水自动维持在 7.0 ± 0.1。搅拌速度和通气速率根据溶解氧（DO）水平进行调整。发酵早期 DO 维持在 20% 以上。发酵后期，搅拌和通气增至最大值，此后 DO 水平通常保持在 5% 以下。使用 pH-stat 补料策略供给含 800 g/L 红糖的浓缩补料液，以在整个发酵过程中将残余红糖维持在较低水平。接种后 6 小时，加入 5 g/L 木糖以及单次推注 25 g/L L-亮氨酸。此后木糖浓度维持在整个过程的 5–10 g/L。补料分批发酵期间，通过循环水配合加热夹套将温度控制在 37 °C。5 L 补料分批发酵作为单次生物反应器运行进行，所呈现的数据……
【数据】LB 琼脂培养：37 ℃、16 h；预培养：3 mL LB、37 ℃、过夜；扩培：100 mL LB、37 ℃、200 rpm、8 h；生物反应器体积：5 L；发酵培养基体积：2.2 L；初始 OD₆₀₀：14.80；搅拌转速：0–800 rpm；红糖：20 g/L；胰蛋白胨：30 g/L；谷氨酸钠：10 g/L；硫酸镁：0.4 g/L；硫酸亚铁：0.2 g/L；磷酸氢二钠：7.5 g/L；磷酸二氢钾：2.5 g/L；pH：7.0 ± 0.1；DO 早期：>20%；DO 后期：<5%；补料红糖：800 g/L；接种后 6 h 补加木糖：5 g/L；L-亮氨酸：25 g/L；木糖维持：5–10 g/L；温度：37 °C
研究结果
3.1 通过调控全局转录调节因子增强表面活性素生物合成
枯草芽孢杆菌以产生表面活性素的能力而广为人知。然而，某些菌株，包括常用的模式菌株枯草芽孢杆菌 168 及其衍生菌株 3NA，由于 sfp 基因突变而无法合成表面活性素。对菌株 ATCC 6051a 的 sfp 进行测序显示其长度为 675 bp（图1A），而菌株 168 中为 676 bp，表明后者存在移码突变。这一结果与菌株 168 通过诱变获得的已知来源一致。Sfp 是表面活性素生物合成所需的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。先前研究已证实，将功能性 sfp 重新引入枯草芽孢杆菌 168 和 3NA 的基因组可恢复表面活性素生产。为选择合适的生产宿主，将功能性 sfp 整合到菌株 168 和 3NA 的基因组中进行评估。ATCC 6051a 表现出比 168 更高的蛋白生产能力，以及强大的生物膜形成和群集运动能力。由于枯草芽孢杆菌的群集运动与表面活性素合成密切相关，ATCC 6051a 成为生物表面活性剂生产的有前景候选菌株。发酵分析证实，Sfp 的功能互补使 168 和 3NA 均能产生表面活性素。然而，在相同培养条件下，菌株 168 和 3NA 的生长劣于野生型 ATCC 6051a，导致表面活性素滴度较低（图1B）。
在先前工作中，将木糖诱导型 comK 基因和木糖诱导型 T7 RNA 聚合酶表达盒整合到枯草芽孢杆菌 ATCC 6051a 的基因组中，生成衍生菌株 164T7P。ATCC 6051a 和 164T7P 的培养显示表面活性素生产差异可忽略不计。在补充甘油的 LB 培养基中生长 72 小时后，ATCC 6051a 和 164T7P 的表面活性素滴度分别约为 168 mg/L 和 169 mg/L（图1B）。菌株 164T7P 相对于其他野生型菌株的关键优势是其转化效率大幅提高——相对于野生型菌株提高了 100 倍以上——这归因于 ComK 的诱导表达增强了自然感受态。由于 ATCC 6051a 和 164T7P 之间的表面活性素滴度相当，且考虑到 164T7P 在遗传操作方面的显著优势，选择该工程菌株作为后续工程改造的底盘。
【数据】sfp 长度：ATCC 6051a 为 675 bp，168 为 676 bp；培养时间：72 h；表面活性素滴度：ATCC 6051a 约 168 mg/L，164T7P 约 169 mg/L；转化效率提升：>100 倍
枯草芽孢杆菌中表面活性素合成通常在指数期向稳定期过渡时启动，并受群体感应调控。因此，该脂肽的产生受多个全局调节因子调控，其中 CodY 蛋白是最早被广泛研究的之一。CodY 作为 DNA 结合蛋白，通过在启动子区域与 RNA 聚合酶竞争来抑制 srfA 操纵子的转录。此外，CodY 抑制 bkd 基因簇的转录，该基因簇参与支链 α-酮酸和脂肪酸的生物合成——这是表面活性素形成的关键前体。先前研究还表明，损害芽孢形成可提高表面活性素滴度（图1C）。基于这些发现，在菌株 164T7P 中依次删除 codY 和 spoIIAC，生成衍生菌株 164LP1（ΔcodY）和 164LP2（ΔspoIIAC）。然而，codY 的删除并未导致表面活性素生产的显著改善；菌株 164LP1 仅产生 162 mg/L，与亲本菌株 164T7P 差异极小（图1D）。类似地，菌株 164LP2 中表面活性素积累相对于 164T7P 略有降低，为 153 mg/L。随后构建了双缺失菌株 164LP3（ΔcodY ΔspoIIAC）。在 164LP3 中观察到细胞密度增加，表面活性素产量出乎意料地上升至 252 mg/L——比 164T7P 提高了 49.11%。这一结果表明，全局调节因子之间的组合效应在调节枯草芽孢杆菌表面活性素生物合成中发挥重要作用。由于 CodY 响应细胞内营养状态并抑制多个靶基因，包括 srfA 操纵子和参与氨基酸及支链脂肪酸前体代谢的基因，codY 的删除可能部分解除营养依赖性抑制，从而提高表面活性素生物合成机器的表达潜力和前体供应能力。相比之下，spoIIAC 编码芽孢形成特异性 sigma 因子 σF，是芽孢形成早期发育程序的关键调控组件。其删除可能阻止细胞进入完整的芽孢分化，从而改变过渡期和稳定期的细胞资源分配。单独删除 codY 或 spoIIAC 后表面活性素产量未明显增加，而双缺失菌株中观察到增加，这表明营养抑制解除与芽孢分化限制之间存在背景依赖性相互作用。这种相互作用可能有利于维持有利于表面活性素生物合成的过渡期代谢状态。
【数据】菌株 164LP1（ΔcodY）表面活性素：162 mg/L；菌株 164LP2（ΔspoIIAC）表面活性素：153 mg/L；菌株 164LP3（ΔcodY ΔspoIIAC）表面活性素：252 mg/L；相对 164T7P 提升：49.11%
接下来，工程改造转向另一个全局调节因子 AbrB，它调节枯草芽孢杆菌从指数生长向稳定期过渡期间的基因表达。对于 srfA 操纵子，AbrB 作为转录抑制因子（图1C）。先前研究表明，abrB 中的特定突变是枯草芽孢杆菌 3NA 中表面活性素产量增强的主要因素。该突变可能减弱 AbrB 介导的转录抑制。因此，将相同的突变引入 164LP3 的 abrB 中，得到衍生菌株 164LP4。如图1D 所示，164LP4 的表面活性素产量相比 164LP3 进一步增加，达到 286 mg/L。菌株 164LP4 所获得的额外改善表明，AbrB 依赖性调控网络的修饰在通过 codY-spoIIAC 双敲除产生的既有调控背景基础上，提升了菌株的表面活性素合成能力。
【数据】菌株 164LP4 表面活性素：286 mg/L
上述修饰靶向抑制 srfA 操纵子的全局调节因子。随后，注意力转向增强已知激活 srfA 转录的调节因子的表达。双组分系统 ComP/ComA 正调控 srfA 操纵子。通常，组氨酸激酶 ComP 响应胞外肽信息素 ComX 而发生自磷酸化。磷酸化的 ComP 随后将磷酸基团转移至响应调节因子 ComA，生成活化的 ComA（ComA~P）。ComA~P 随后结合 srfA 操纵子的启动子区域，从而诱导其转录。由于 164LP4 携带 T7 RNA 聚合酶，将该菌株中 comA 基因的天然启动子替换为 T7 启动子，生成衍生菌株 164LP5。在相同条件下培养，164LP5 的表面活性素滴度为 315 mg/L。菌株 164LP5 获得的改善表面活性素滴度验证了增强 ComA 依赖性调控对表面活性素生物合成产生有利影响。为进一步提高产量，将位于 srfA 操纵子正下游的 sfp 天然启动子也在菌株 164LP5 中替换为 T7 启动子，得到菌株 164LP6。然而，164LP6 的表面活性素产量（290 mg/L）与 164LP5 无显著差异（图1D）。164LP6 中表面活性素产量未进一步增加表明，在当前遗传背景和培养条件下，额外增强 sfp 表达不是有效策略，现有 Sfp 表达水平可能足以支持当前的生物合成通量。
【数据】菌株 164LP5 表面活性素：315 mg/L；菌株 164LP6 表面活性素：290 mg/L
讨论与解读
本研究以携带完整天然 sfp 基因和表面活性素生物合成机器的枯草芽孢杆菌 ATCC 6051a 为原始菌株背景。以先前建立的携带诱导型异源 T7 RNA 聚合酶系统的 ATCC 6051a 衍生底盘作为后续全局调控、关键基因表达、前体代谢和分泌/转运过程工程改造的平台。菌株开发过程中引入的主要遗传修饰及其相应的工程目标总结于表 2。结合培养基优化和前体补充，这些工程干预将摇瓶表面活性素滴度从菌株 164LP7-1 的 1.75 g/L 提高到最终菌株 164LP15 的 19.22 g/L。在优化的高滴度培养体系之外，还使用麦麸作为低成本农业工业原料进一步评估了菌株 164LP15 的生产性能。在补充红糖作为主要外源碳源的麦麸基培养基中，164LP15 在摇瓶规模下无需额外添加 L-亮氨酸、谷氨酸钠或微量元素即产生 7.49 g/L 表面活性素，展示了其在简化培养条件下保持可观表面活性素产量、减少对精制补充剂依赖的能力。164LP15 的放大潜力进一步在 5 L 补料分批生物反应器中得到验证，表面活性素滴度在 27 小时内达到 52.32 g/L，对应平均生产强度为 1.94 g/L/h。多层次菌株工程与发酵优化的整合由此确立了枯草芽孢杆菌 ATCC 6051a 作为高水平表面活性素生产的有效平台，并为开发高效微生物表面活性素生产系统提供了实用框架。
编译者解读
该研究的方法论核心在于"底盘选择—调控网络解耦—前体/分泌协同"的逐层递进策略。选择 ATCC 6051a 而非模式菌株 168 作为底盘是明智之举——完整 sfp 基因省去了补偿突变的步骤，而高转化效率的 164T7P 衍生株为多轮编辑提供了可操作性。全局调控因子的组合敲除（codY/spoIIAC/abrB）揭示了单一靶点无效而组合有效的非线性效应，提示合成生物学中调控网络的多节点协同优于单基因优化。然而，该研究在 sfp 过表达上的无效结果也说明，当上游通量已足够时，下游酶的过量表达并非总是增益。5 L 规模 52.32 g/L 的产量令人瞩目，但单次运行（n=1）的数据限制了统计可靠性，未来需多批次验证。
参考来源
期刊：Journal of Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.09.008
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.09.008