来源：High-level biosynthesis of gastrodin in engineered Escherichia coli（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
天麻素是名贵中药天麻的主要活性成分，临床需求量大，但植物提取成本高昂。本研究从六种植物来源的UDP-糖基转移酶中筛选出催化效率最高的RrUGT，通过共表达UDP-葡萄糖合成途径关键酶、优化碳源与发酵条件，在大肠杆菌中实现了4578.03 mg/L的天麻素产量，摩尔转化率达82.72%，为目前大肠杆菌体系报道的最高水平。
研究背景
天麻素化学名为对羟基苯甲醇-β-D-吡喃葡萄糖苷，属于酚苷类化合物，是中药天麻的核心活性成分。它在心血管疾病治疗中表现出良好的临床效果，广泛用于头晕、头痛、癫痫等疾病的辅助治疗。此外，天麻素还具有抗酒精性肝损伤、抗焦虑、抗炎及增强记忆等多种药理活性。近期系统综述进一步确认了其神经保护作用，尤其是在脑缺血再灌注损伤中的效果。目前市场上已有多种天麻素药物和保健品。
天麻素最初通过植物提取获得，但天麻植物资源稀缺，提取成本高昂，限制了其广泛应用。化学全合成虽然大幅降低了生产成本，但化学合成路线仍存在诸多不足。因此，构建微生物细胞工厂、以合成生物学手段高效生产天麻素，成为一条颇具吸引力的替代路径。
研究方法
2.1 质粒、菌株、培养基与化学试剂
本研究使用的所有质粒和菌株详情见补充表S1。重组菌株在含适宜抗生素的LB和TB培养基中培养。LB培养基含5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨和10 g/L NaCl；TB培养基含24 g/L酵母提取物、12 g/L胰蛋白胨、17 mmol/L K₂HPO₄、17 mmol/L KH₂PO₄和0.4%甘油。限制性内切酶、BL21(DE3)感受态细胞和蛋白Marker均购自全式金（北京，中国）。Bradford蛋白定量试剂盒购自碧云天（上海，中国）。GSTSep谷胱甘肽琼脂糖树脂购自翊圣（上海，中国）。胰蛋白胨和酵母提取物购自OXOID（贝辛斯托克，英国）。其他化学试剂购自阿拉丁（上海，中国）。
【数据】LB培养基：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl；TB培养基：24 g/L酵母提取物、12 g/L胰蛋白胨、17 mmol/L K₂HPO₄、17 mmol/L KH₂PO₄、0.4%甘油；抗生素：100 mg/L氨苄青霉素；原文未详述其他试剂用量
2.2 质粒构建
将来源于番茄的SlyUGT（GenBank号NP_001307116.1）、红景天的RrUGT（GenBank号AUl41117.1）、蛇根木的RsUGT（GenBank号Q9AR73.1）、拟南芥的AtUGT（GenBank号AAG52529.1）、高山红景天的UGT73B6 F389S（GenBank号AY547304.1）和木蓝的ItUGT（GenBank号LC198655.1）基因，按照大肠杆菌密码子偏好性进行优化后，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。将各合成基因通过BamH I和EcoR I限制性内切酶消化后插入pGEX−2T表达载体，构建重组质粒pGEX-SlyUGT、pGEX-RrUGT、pGEX-RsUGT、pGEX-AtUGT、pGEX-UGT73B6F389S和pGEX-ItUGT（补充表S1）。重组质粒pACYCDuet-Pgm-GalU（pACYC-PG）为本课题组前期研究工作所构建（补充表S1）（Pei et al., 2016）。
【数据】基因来源：番茄、红景天、蛇根木、拟南芥、高山红景天、木蓝；限制性内切酶：BamH I、EcoR I；载体：pGEX−2T、pACYCDuet；原文未详述其他参数
2.3 RrUGT的表达与纯化
将质粒pGEX-RrUGT转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得菌株BL-RrUGT。该菌株在含100 mg/L氨苄青霉素的50 mL LB培养基中于37℃培养至OD₆₀₀达到0.6–0.8，然后加入0.2 mM IPTG诱导重组RrUGT表达，并在16℃、20℃、30℃和37℃下继续培养24 h。通过SDS-PAGE检测重组RrUGT的表达，并测定其酶活性。培养液经离心（6000 g，10 min）收集，洗涤后重悬于PBS（pH 7.4）中。细胞破碎后，上清液以2 mL/min流速上样至GST亲和柱。用PBS洗涤去除未结合蛋白后，用含10 mM谷胱甘肽的PBS洗脱目标蛋白。洗脱液对PBS透析（4℃，换液4次/2 h），加入30%甘油后于−80℃保存。通过SDS-PAGE评估蛋白纯度，随后测定RrUGT活性。使用Bradford蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度（Bradford, 1976）。样品与Bradford试剂在30℃孵育10 min，随后在595 nm波长下进行分光光度分析。
【数据】菌株：BL-RrUGT；培养基：50 mL LB + 100 mg/L氨苄青霉素；诱导温度：16℃、20℃、30℃、37℃；诱导剂：0.2 mM IPTG；诱导时间：24 h；离心条件：6000 g、10 min；上样流速：2 mL/min；洗脱液：10 mM谷胱甘肽/PBS；透析：4℃、换液4次/2 h；甘油浓度：30%；检测波长：595 nm；孵育温度：30℃；孵育时间：10 min
2.4 RrUGT酶活测定
酶活测定体系包括1 mM pHBA、50 mM PB缓冲液（调至pH 7.5）、1 mM UDP-葡萄糖和适量纯化RrUGT。反应温度和时间为40℃和10 min。反应结束后，加入900 μL色谱级甲醇和4 μL 10%三氟乙酸水溶液。最后，通过高效液相色谱（HPLC）定量反应体系中天麻素的含量，方法参照本课题组前期工作（Ge et al., 2025）。酶活单位定义为在40℃、pH 7.5反应检测条件下，每分钟产生1 μmol天麻素所需的酶量。
【数据】底物：1 mM pHBA；缓冲液：50 mM PB（pH 7.5）；糖基供体：1 mM UDP-葡萄糖；反应温度：40℃；反应时间：10 min；终止液：900 μL甲醇 + 4 μL 10%三氟乙酸；酶活定义：40℃、pH 7.5下每分钟产生1 μmol天麻素
2.5 RrUGT酶学性质表征
在上述标准酶活测定条件下，通过评估RrUGT在不同pH缓冲液中的活性来确定最适pH，包括柠檬酸-磷酸缓冲液（6.0、6.5、7.0、7.5和8.0）、PB缓冲液（6.0、6.5、7.0、7.5和8.0）、Tris-HCl（7.0、7.5、8.0、8.5和9.0）以及甘氨酸缓冲液（8.5、9.0和9.5）。在确定的最适pH下，通过评估RrUGT在不同温度下的活性来确定最适温度，包括30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃。为确定RrUGT的热稳定性，在PB缓冲液pH 7.5条件下，测定酶在40℃、45℃和50℃下的失活率。为评估RrUGT的pH稳定性，将酶液与三种不同pH的缓冲液按1:1比例混合，随后在40℃孵育4 h，最后测定RrUGT的剩余酶活。通过构建Michaelis-Menten曲线测定RrUGT的K_M和V_max值。具体方法为：在最适pH 7.5、温度50℃条件下，使用不同浓度的pHBA（0.2、0.4、0.5、1、2、3和4 mM）评估初始反应速率，持续10 min。
【数据】pH缓冲液种类：柠檬酸-磷酸、PB、Tris-HCl、甘氨酸；pH范围：6.0–9.5；温度范围：30℃–60℃；热稳定性温度：40℃、45℃、50℃；pH稳定性孵育：40℃、4 h；pH稳定性混合比例：1:1；动力学pHBA浓度：0.2、0.4、0.5、1、2、3、4 mM；动力学温度：50℃；动力学时间：10 min
2.6 重组菌株生物转化合成天麻素
为评估不同UGT合成天麻素的能力，将质粒pGEX-SlyUGT、pGEX-RrUGT、pGEX-RsUGT、pGEX-AtUGT、pGEX-UGT73B6 F389S和pGEX-ItUGT通过热激转化法导入BL21(DE3)细胞，分别获得重组菌株BL-SlyUGT、BL-RrUGT、BL-RsUGT、BL-AtUGT、BL-UGT73B6 F389S和BL-ItUGT。然后将六株重组菌株无菌接种至含100 µg/mL氨苄青霉素的50 mL LB培养基中，于37℃培养至OD₆₀₀达到1.0。随后向培养液中加入终浓度1 g/L的pHBA（DMSO溶解）和0.1 mM IPTG，于30℃、180 rpm条件下孵育42 h。发酵结束后，取100 μL发酵液转移至离心管中，加入900 μL甲醇和4 μL 10%三氟乙酸（TFA）水溶液。样品经12,000 rpm离心10 min，随后用0.22 mm有机滤膜过滤。采用HPLC进行分析，参数与前期研究一致（Ge et al., 2025）。
【数据】菌株：BL-SlyUGT、BL-RrUGT、BL-RsUGT、BL-AtUGT、BL-UGT73B6 F389S、BL-ItUGT；培养基：50 mL LB + 100 µg/mL氨苄青霉素；诱导OD₆₀₀：1.0；pHBA终浓度：1 g/L（DMSO溶解）；IPTG终浓度：0.1 mM；发酵温度：30℃；转速：180 rpm；发酵时间：42 h；取样量：100 μL；甲醇：900 μL；TFA：4 μL 10%水溶液；离心：12,000 rpm、10 min；滤膜：0.22 mm
2.7 UDP-葡萄糖供给对天麻素产量的影响
将重组表达载体pGEX-RrUGT/pACYC-PG共转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌株BL-Rr-PG。该菌株无菌接种至含6 mL LB培养基（含100 µg/mL氨苄青霉素和50 µg/mL氯霉素）的试管中，于37℃培养18 h。然后将0.5 mL种子液无菌接种至含50 mL LB或TB培养基的摇瓶中，培养基含100 µg/mL氨苄青霉素和50 µg/mL氯霉素，于37℃培养。当OD₆₀₀达到0.8时，向摇瓶中加入终浓度1 g/L的pHBA（DMSO溶解）、0.1 mM IPTG和5 g/L葡萄糖。发酵液于30℃孵育42 h。样品处理和分析方法同上。
【数据】菌株：BL-Rr-PG；种子培养基：6 mL LB + 100 µg/mL氨苄青霉素 + 50 µg/mL氯霉素；种子培养：37℃、18 h；接种量：0.5 mL；发酵培养基：50 mL LB或TB + 100 µg/mL氨苄青霉素 + 50 µg/mL氯霉素；诱导OD₆₀₀：0.8；pHBA终浓度：1 g/L（DMSO溶解）；IPTG终浓度：0.1 mM；葡萄糖终浓度：5 g/L；发酵温度：30℃；发酵时间：42 h
2.8 BL-Rr-PG合成天麻素条件的优化
将重组菌株BL-Rr-PG无菌接种至含6 mL TB-Gly培养基（含100 µg/mL氨苄青霉素和50 µg/mL氯霉素）的试管中，于37℃培养18 h。然后将种子液以1%接种量无菌接种至含50 mL TB-Gly培养基的摇瓶中，于37℃继续培养，并加入100 µg/mL氨苄青霉素和50 µg/mL氯霉素。当OD₆₀₀达到0.8时，向摇瓶中加入终浓度1 g/L的pHBA（DMSO溶解）、0.1 mM IPTG和5 g/L葡萄糖。发酵液于30℃孵育42 h。
【数据】菌株：BL-Rr-PG；种子培养基：6 mL TB-Gly + 100 µg/mL氨苄青霉素 + 50 µg/mL氯霉素；种子培养：37℃、18 h；接种量：1%；发酵培养基：50 mL TB-Gly + 100 µg/mL氨苄青霉素 + 50 µg/mL氯霉素；诱导OD₆₀₀：0.8；pHBA终浓度：1 g/L（DMSO溶解）；IPTG终浓度：0.1 mM；葡萄糖终浓度：5 g/L；发酵温度：30℃；发酵时间：42 h
研究结果
3.1 筛选pHBA糖基化UGT基因
天麻素与pHBA在结构上仅差一个葡萄糖残基。因此，为获得天麻素，本研究选取了六个植物来源的糖基转移酶基因来测定其对pHBA的糖基化能力，即来源于番茄的SlyUGT（GenBank号NP_001307116.1）、红景天的RrUGT（GenBank号AUl41117.1）、蛇根木的RsUGT（GenBank号Q9AR73.1）、拟南芥的AtUGT（GenBank号AAG52529.1）、高山红景天的UGT73B6 F389S（GenBank号AY547304.1）和木蓝的ItUGT（GenBank号LC198655.1）。已有报道表明，与GST融合表达有利于提高植物来源蛋白的可溶性表达（Pei et al., 2016）。因此，将SlyUGT、RrUGT、RsUGT、AtUGT、UGT73B6 F389S和ItUGT按大肠杆菌密码子进行优化，并克隆至pGEX−2T中与GST融合。如图2所示，BL-RrUGT合成天麻素的滴度最高，达到210.60 mg/L，分别比重组菌株BL-SlyUGT、BL-RsUGT、BL-AtUGT、BL−73B6UGT和BL-ItUGT高出41.28%、33.19%、64.69%、74.18%和21.31%（图2B）。结果表明，重组菌株BL-RrUGT在天麻素生物合成中具有明显优势。
【数据】菌株：BL-RrUGT、BL-SlyUGT、BL-RsUGT、BL-AtUGT、BL-73B6UGT、BL-ItUGT；天麻素滴度：210.60 mg/L（BL-RrUGT最高）；较其他菌株提高：41.28%、33.19%、64.69%、74.18%、21.31%；n=3
3.2 RrUGT的纯化与表征
如补充表S2所示，纯化后的重组酶RrUGT回收率为49.7%，纯化后比活为152.0 mU/mg，为粗酶液的19.5倍。SDS-PAGE分析显示，纯化的RrUGT纯度较高，其单体分子量约为78 kDa（图3，泳道11）。以pHBA为底物，研究了纯化RrUGT活性与pH和温度的关系，因为这两个因素是酶反应的关键因素。如图4A所示，使用PB缓冲液时RrUGT的最适pH为7.5，其活性是Tris-HCl缓冲液中的3.5倍，表明RrUGT更适合在含PB缓冲液的体系中使用。这一现象在其他来源糖基转移酶的研究报告中也有记载（Devaiah et al., 2016; Pei et al., 2016）。在温度方面，RrUGT在50℃时检测到最高相对酶活（图4B），在30℃至60℃范围内保留了超过50%的最高活性，表明其具有在较宽温度范围内应用的潜力。酶的热稳定性和pH稳定性是工业应用中需要考虑的重要因素。因此，评估了RrUGT在40℃、45℃和50℃下的热稳定性。如图4C所示，RrUGT在40℃保持360 min后仍保留超过90%的初始酶活，表明RrUGT在40℃下的热稳定性显著高于来源于番茄的SlyUGT和蛇根木的RsUGT（Ge et al., 2025, 2024）。此外，RrUGT在45℃和50℃下也表现出良好的热稳定性（图4C）。45℃下的半衰期约为360 min，分别是SlyUGT（半衰期45 min）和RsUGT（半衰期60 min）的8倍和6倍。此外，还系统研究了RrUGT的pH稳定性。结果显示，该酶在pH 6.0至9.5的缓冲液中表现出显著稳定性，保留了超过75%的相对酶活（图4D）。Michaelis-Menten动力学模型为酶浓度和底物浓度影响下的酶催化反应速率提供了有价值的见解（Kareem et al., 2024）。在本研究中，通过双倒数Lineweaver-Burk图分析测定了RrUGT的动力学参数。结果显示，米氏常数（K_M）为0.75 mM，最大反应速率（V_max）为327.98 mU/mg，高于SlyUGT和RsUGT（Ge et al., 2025, 2024）。这些结果表明，重组RrUGT对pHBA表现出良好的亲和力，突出了其催化该底物反应的潜在效率。
【数据】回收率：49.7%；纯化后比活：152.0 mU/mg（粗酶的19.5倍）；分子量：约78 kDa；最适pH：7.5（PB缓冲液，为Tris-HCl的3.5倍）；最适温度：50℃；温度范围：30℃–60℃（保留>50%活性）；40℃热稳定性：360 min后保留>90%；45℃半衰期：约360 min（SlyUGT的8倍，RsUGT的6倍）；pH稳定性：pH 6.0–9.5保留>75%；K_M：0.75 mM；V_max：327.98 mU/mg
3.3 UDP-葡萄糖供给对天麻素产量的影响
pHBA生物转化为天麻素需要UDP-葡萄糖作为糖基供体。前期研究表明，增强大肠杆菌胞内UDP-葡萄糖供给可显著提高目标产物滴度。因此，本研究考察了增加UDP-葡萄糖可用性对天麻素滴度的影响。为评估增强UDP-葡萄糖供给的效果，比较了重组菌株BL-RrUGT和BL-Rr-PG的天麻素滴度。如图5所示，无论是否添加5 g/L葡萄糖，TB培养基中天麻素生物合成的滴度均显著高于LB培养基。在未添加葡萄糖的LB或TB培养基中，BL-RrUGT和BL-Rr-PG之间的天麻素滴度无显著差异。这表明，尽管过表达了UDP-葡萄糖合成关键酶基因，但由于葡萄糖作为前体不足，UDP-葡萄糖水平无法提高。然而，在补充5 g/L葡萄糖后，BL-Rr-PG在两种培养基中的天麻素滴度均超过BL-RrUGT 48.0%以上。这一观察结果与Pei等人报道的发现一致（Pei et al., 2016）。具体而言，BL-Rr-PG在TB培养基中产生的天麻素滴度达到549.9 mg/L，是LB培养基中的1.6倍。总体而言，这些结果表明，通过过表达大肠杆菌内源性UDP-葡萄糖生物合成途径中的关键酶基因，可显著提高天麻素滴度。此外，TB培养基比LB培养基更有利于天麻素生物合成。
【数据】菌株：BL-RrUGT、BL-Rr-PG；葡萄糖添加量：5 g/L；BL-Rr-PG较BL-RrUGT提高：>48.0%；BL-Rr-PG在TB中滴度：549.9 mg/L；TB/LB比值：1.6倍；n=3
3.4 不同浓度甘油和葡萄糖对天麻素滴度的影响
作为碳源，甘油浓度显著影响大肠杆菌生长、酶表达以及最终的天麻素生物合成。因此，评估了不同甘油浓度对天麻素滴度的影响。如图6A所示，甘油浓度为4%时获得最佳滴度715.89 mg/L，相比0.4%甘油时的滴度提高了31.15%。已有充分文献表明，适当补充碳源不仅能减少乙酸积累，还能提高产物产量（Pei et al., 2019; Shi et al., 2017）。因此，4%甘油条件下的优异表现可能归因于更有利的代谢条件，抑制效应降低。作为UDP-葡萄糖合成的前体，葡萄糖浓度直接影响UDP-葡萄糖的可用性，进而影响天麻素滴度。为研究这一关系，评估了不同葡萄糖浓度对天麻素产量的影响。当葡萄糖浓度补充至8 g/L时，获得最大滴度965.31 mg/L（图6B），超过此浓度后，天麻素产量显著下降。高葡萄糖浓度通常导致乙酸过度积累，从而损害产物得率（Liu et al., 2024），这可能解释了高葡萄糖水平对天麻素生物合成的不利影响。
【数据】最佳甘油浓度：4%；天麻素滴度：715.89 mg/L；较0.4%甘油提高：31.15%；最佳葡萄糖浓度：8 g/L；天麻素滴度：965.31 mg/L；n=3
3.5 BL-Rr-PG合成天麻素培养条件的优化
植物来源基因在大肠杆菌中的异源表达常导致包涵体形成（Ray et al., 2012）。因此，首先研究了不同诱导温度对重组菌株BL-Rr-PG天麻素生物合成滴度的影响。如图7A所示，最佳诱导温度为16℃，相应的天麻素滴度为1640.20 mg/L。
【数据】菌株：BL-Rr-PG；最佳诱导温度：16℃；天麻素滴度：1640.20 mg/L；n=3
讨论与解读
本研究通过系统筛选六种植物来源的UDP-糖基转移酶，确定红景天来源的RrUGT是合成天麻素的最优酶。RrUGT的K_M为0.75 mM，V_max为327.98 mU/mg，对pHBA具有良好亲和力。在此基础上，通过过表达大肠杆菌内源性UDP-葡萄糖合成途径的两个关键酶——磷酸葡萄糖变位酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，将天麻素滴度从210.60 mg/L提升至342.40 mg/L。随后对培养基和发酵条件进行系统优化，最终在摇瓶水平实现了4578.03 mg/L的天麻素滴度，比生产率达69.36 mg/L/h，摩尔转化率为82.72%，为目前大肠杆菌体系中报道的最高产量。
【数据】天麻素最高滴度：4578.03 mg/L；比生产率：69.36 mg/L/h；摩尔转化率：82.72%；初始滴度：210.60 mg/L；UDP-葡萄糖增强后：342.40 mg/L；n=3
编译者解读
该研究的技术路线清晰务实：先筛酶、再补代谢前体、后优发酵，层层递进。RrUGT的热稳定性（45℃半衰期360 min）和宽pH耐受（6.0–9.5保留>75%活性）是产业化的重要加分项。82.72%的摩尔转化率说明底物利用已相当充分，但4578 mg/L的摇瓶滴度距工业化仍有距离。未来若能在 fed-batch 发酵罐中进一步优化供氧与补料策略，并解决DMSO助溶带来的潜在毒性问题，该体系有望成为天麻素绿色制造的有力候选。
参考来源
期刊：Journal of Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.06.014
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.06.014