来源：Programming 2,3-butanediol biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae with AI-optimized dual-optogenetic switches（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
微生物细胞工厂在可持续生物制造中潜力巨大，但细胞生长与产物合成之间的平衡始终是生产力瓶颈。本研究在酿酒酵母BY4742中构建了2,3-丁二醇（2,3-BDO）合成路径，并部署了基于光控蛋白降解与稳定的双模式光遗传开关，实现生长与生产阶段的动态协调。结合卷积神经网络与差分进化算法优化光照策略，摇瓶中2,3-BDO滴度提升至静态对照的3.52倍，模型预测并实验验证进一步增加15.60%。在5-L光生物反应器中，补料分批条件下产量达23.95 g L⁻¹。
研究背景
可持续生物制造需求日益增长，精准代谢调控以最大化生物合成效率仍是代谢工程的核心挑战。基因过表达和敲除等静态策略缺乏时空分辨率，难以平衡细胞生长与产物合成。动态调控能够适应胞内代谢状态和胞外条件，实时调节代谢通量，平衡生物量与产物合成之间的碳分配。现有策略主要依赖合成生物开关，包括半乳糖诱导的Cre-lox系统、工程化RNA聚合酶-转录因子互作、CRISPR干扰和群体感应回路等。但这些系统通常依赖化学诱导剂或内源信号分子，受响应延迟和宿主代谢串扰限制，制约了发酵过程中代谢途径的实时调控。光具有无毒、可逆、非侵入性等特点，是实时代谢调控的理想诱导剂。
研究方法
2.1 实验菌株
酿酒酵母BY4742（源自S288C；MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0）用作亲本菌株。除携带异源质粒的菌株外，所有菌株均通过PCR扩增的DNA盒同源重组染色体整合产生，用于psd/SULI标签插入和PDC5/PDC6缺失。工程菌株的完整列表、基因型及相应异源质粒见电子补充数据。大肠杆菌DH5α用于质粒构建和扩增。
【数据】菌株：BY4742（MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0）；亲本来源：S288C；大肠杆菌菌株：DH5α；原文未详述培养温度和时间
2.2 DNA组装与质粒构建
DNA凝胶回收、PCR纯化和质粒提取使用Thermo Fisher Scientific的商业试剂盒。alsS、alsD和noxC基因从枯草芽孢杆菌168基因组DNA扩增；nox1和nox2从副干酪乳杆菌基因组DNA扩增；noxE从乳酸乳球菌基因组DNA扩增；nox从罗伊氏粘液乳杆菌基因组DNA扩增。其他遗传元件，包括用于酵母转化和质粒构建的启动子和编码序列，从S288C基因组DNA扩增。染色体整合盒通过重叠延伸PCR组装。质粒使用Seamless Cloning Kit（Beyotime）构建。为在BY4742中使用LYS2作为营养缺陷型标记实现异源基因表达，通过将pYES2的URA3标记替换为从S288C基因组扩增的LYS2盒，生成pYES2L骨架。含有PPGK1、alsS、TPGK1、PTDH3、alsD、TCYC1、PFBA1及NADH氧化酶变体LPnox1、LPnox2、BsnoxC、LLnoxE和LRnox的转录单元被组装并插入反向PCR线性化的pYES2L中，生成pYES2L_SD和pYES2L_SDN质粒系列。
【数据】来源菌株：枯草芽孢杆菌168、副干酪乳杆菌、乳酸乳球菌、罗伊氏粘液乳杆菌、S288C；质粒骨架：pYES2L；标记：LYS2；试剂盒：Seamless Cloning Kit（Beyotime）；原文未详述PCR扩增条件
2.3 培养基与培养条件
YPD培养基含10 g L⁻¹酵母提取物、20 g L⁻¹蛋白胨和20 g L⁻¹葡萄糖。SD培养基含20 g L⁻¹葡萄糖、6.67 g L⁻¹无氨基酸酵母氮源、1.19 g L⁻¹缺省补充物，以及200 mg L⁻¹的组氨酸、亮氨酸、赖氨酸和尿嘧啶。固体培养基添加20 g L⁻¹琼脂。发酵培养基含20 g L⁻¹葡萄糖、7 g L⁻¹ (NH₄)₂SO₄、5 g L⁻¹ K₂HPO₄、0.5 g L⁻¹ MgSO₄、1.4 g L⁻¹酵母氮源，以及0.4 g L⁻¹的组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶，补充1 mL L⁻¹微量元素溶液和2 mL L⁻¹维生素溶液。微量元素溶液含19 g L⁻¹ Na₂EDTA·2H₂O、4.5 g L⁻¹ CaCl₂·2H₂O、4.5 g L⁻¹ ZnSO₄·7H₂O、3 g L⁻¹ FeSO₄·7H₂O、1 g L⁻¹ MnCl₂·4H₂O、1 g L⁻¹ H₃BO₃、0.4 g L⁻¹ Na₂MoO₄·2H₂O、0.3 g L⁻¹ CoCl₂·6H₂O、0.3 g L⁻¹ CuSO₄·5H₂O和0.1 g L⁻¹ KI。维生素溶液含25 g L⁻¹肌醇、1 g L⁻¹ d-泛酸半钙盐、1 g L⁻¹硫胺素-HCl、1 g L⁻¹吡哆醇-HCl、1 g L⁻¹烟酸、0.2 g L⁻¹对氨基苯甲酸和0.05 g L⁻¹ d-生物素。摇瓶发酵时，将单菌落接种至50-mL离心管中的10 mL SD培养基，在30 °C、220 rpm培养24 h。种子培养物转接至250-mL锥形瓶中的50 mL SD培养基，相同条件下再培养24 h。二级种子培养物接种至250-mL锥形瓶或5-L光生物反应器中的50 mL发酵培养基，初始OD600为0.3。培养物维持30 °C、220 rpm。根据实验设计在指定发酵阶段施加蓝色LED面板（460 nm，20 μmol m⁻² s⁻¹）。
【数据】培养基：YPD（10 g L⁻¹酵母提取物、20 g L⁻¹蛋白胨、20 g L⁻¹葡萄糖）；SD（20 g L⁻¹葡萄糖、6.67 g L⁻¹酵母氮源、1.19 g L⁻¹缺省补充物）；发酵培养基：20 g L⁻¹葡萄糖、7 g L⁻¹ (NH₄)₂SO₄、5 g L⁻¹ K₂HPO₄、0.5 g L⁻¹ MgSO₄；温度：30 °C；转速：220 rpm；初始OD600：0.3；光照：460 nm，20 μmol m⁻² s⁻¹；培养时间：种子24 h + 24 h
2.4 酵母转化
酵母转化使用标准醋酸锂法。在YPD或SD培养基中过夜培养的细胞转接至新鲜培养基，在OD600 = 0.6–0.8时收集用于转化。转化子根据相应营养缺陷型标记在SD琼脂平板上筛选，或在含300 μg mL⁻¹ G418的SD琼脂上筛选。
【数据】转化方法：醋酸锂法；收集OD600：0.6–0.8；G418浓度：300 μg mL⁻¹；原文未详述转化具体步骤参数
2.5 分析方法
细胞生长通过测定600 nm光密度（OD600）确定。发酵液分析前经0.22-μm膜过滤。胞外代谢物包括葡萄糖、甘油、乙醇、乙偶姻和2,3-BDO，使用Agilent 1260 Infinity高效液相色谱系统（配备示差折光检测器）定量。分离在Aminex HPX-87H柱（300 × 7.8 mm，9 μm；Bio-Rad，USA）上进行，温度65 °C，以5 mM H₂SO₄为流动相，流速0.6 mL min⁻¹。
【数据】检测波长：600 nm；滤膜孔径：0.22 μm；色谱柱：Aminex HPX-87H（300 × 7.8 mm，9 μm）；柱温：65 °C；流动相：5 mM H₂SO₄；流速：0.6 mL min⁻¹；检测器：示差折光检测器
2.6 实时定量PCR（RT–qPCR）
使用Yeast Processing Reagent（TaKaRa，Japan）从酿酒酵母中提取总RNA。RNA浓度和纯度使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，USA）测定。使用PrimeScript™ RT Reagent Kit（TaKaRa，Japan）从1 μL总RNA合成第一链cDNA。RT–qPCR在CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad，USA）上使用TB Green® Premix Ex Taq™ II（TaKaRa，Japan）进行。每个20 μL反应体系含10 μL 2 × TB Green Premix、0.4 μM各引物、1 μL稀释cDNA和无核酸酶水。扩增程序为95 °C初始变性30 s，随后35个循环的95 °C 5 s和60 °C 30 s。进行熔解曲线分析验证扩增特异性。所有反应设技术三重复。以ACT1为参考基因，相对转录水平使用2^−ΔΔCt方法计算。
【数据】RNA提取试剂：Yeast Processing Reagent（TaKaRa）；RNA测定：NanoDrop 2000；cDNA合成试剂盒：PrimeScript™ RT Reagent Kit；qPCR体系：20 μL（10 μL 2 × TB Green Premix、0.4 μM引物、1 μL cDNA）；变性：95 °C 30 s；循环：35个（95 °C 5 s，60 °C 30 s）；参考基因：ACT1；计算方法：2^−ΔΔCt；技术重复：3
2.7 代谢通量分析
代谢通量分析使用酿酒酵母酶约束基因组规模代谢模型ecYeast8进行。为研究对蓝光诱导的代谢响应，工程菌株BYSD_BSPP在黑暗和蓝光条件下培养。在指数生长期收集样品，实验组施加蓝光照射，测定葡萄糖、氧气、生物量、甘油、乙偶姻、乙醇和2,3-BDO的比吸收和分泌速率。这些实验测定的速率用作ecYeast8模型的边界约束。随后以最大化2,3-BDO产量为目标函数进行通量平衡分析，比较两种光照条件下的胞内代谢通量分布。
【数据】模型：ecYeast8；菌株：BYSD_BSPP；光照条件：黑暗和蓝光；目标函数：最大化2,3-BDO产量；测定代谢物：葡萄糖、氧气、生物量、甘油、乙偶姻、乙醇、2,3-BDO；原文未详述具体通量数值
2.8 细胞干重与生物量归一化2,3-BDO产量
细胞干重（DCW）通过重量法测定。72 h收集的发酵液样品离心，细胞沉淀用去离子水洗涤两次，干燥至恒重。生物量归一化2,3-BDO产量对每个生物学重复单独计算，将胞外2,3-BDO浓度除以72 h测定的相应DCW浓度，表示为g 2,3-BDO g⁻¹ DCW。
【数据】取样时间：72 h；洗涤：去离子水2次；干燥：至恒重；单位：g 2,3-BDO g⁻¹ DCW
2.9 模型建立
开发CNN从光强度时间序列数据预测最终2,3-BDO滴度。CNN可直接从序列输入中提取局部时间特征，已广泛应用于时间序列回归任务。数据集包含33个独立发酵曲线。每种光照模式保留一个曲线作为独立留出测试集（n = 4），其余29个曲线用于模型开发。开发集内的模型性能通过留一发酵曲线交叉验证评估。数据增强方面，向29个开发曲线添加零均值高斯噪声，标准差等于各原始光强度序列标准差的5%。每个原始曲线生成一个增强序列，最终模型开发数据集包含58个输入序列，包括29个原始曲线和29个增强对应物。交叉验证期间，增强……
【数据】数据集：33个独立发酵曲线；测试集：4个（每种光照模式1个）；开发集：29个；增强后：58个序列（29原始+29增强）；噪声：零均值高斯噪声，标准差为原始序列的5%；交叉验证：留一发酵曲线交叉验证
研究结果
3.1 单一光遗传模块提高酿酒酵母中2,3-BDO生物合成
酿酒酵母BY4742用作亲本菌株。工程化前，评估了其内源2,3-BDO生产能力。72 h发酵期间仅检测到可忽略的2,3-BDO和痕量乙偶姻（见补充材料），与酵母中天然2,3-BDO途径的低活性一致。为增加从丙酮酸到2,3-BDO前体的碳通量，将来自枯草芽孢杆菌168的alsS（乙酰乳酸合酶）和alsD（乙酰乳酸脱羧酶）基因组成的异源生物合成途径引入BY4742，获得菌株BYSD。发酵分析显示，菌株BYSD在72 h后积累0.54 g L⁻¹ 2,3-BDO（见补充材料），证实异源途径的建立。为进一步提高2,3-BDO产量，采用光遗传策略在翻译后水平动态调控关键代谢酶。具体而言，使用psd和SULI模块调控乙醇生物合成途径和2,3-BDO生物合成途径（图1a和b）。通过将psd融合到丙酮酸脱羧酶（PDC1）C端构建菌株BYSD_PP1。psd标签在黑暗中稳定融合蛋白，但在蓝光下促进其快速蛋白酶体降解。由于PDC1对细胞生长必需，培养物首先在黑暗中孵育12 h以积累生物量，随后进行蓝光诱导（12D → BL）。在12D → BL方案下，BYSD_PP1的2,3-BDO滴度从持续黑暗（d-only）下的0.57 g L⁻¹增加到0.79 g L⁻¹（图1c；见补充材料）。这一增加与丙酮酸部分重新分配至2,3-BDO合成一致，尽管其幅度适中，表明残余丙酮酸脱羧酶活性可能限制了进一步改善。在酿酒酵母中，丙酮酸脱羧酶活性与三个同工酶编码基因相关：PDC1、PDC5和PDC6。RT-qPCR分析显示PDC1在这些基因中转录丰度最高（见补充材料）。然而，PDC5和PDC6可能部分补偿了光诱导的PDC1损失，从而维持了流向乙醇生产的碳通量。为减少这种潜在补偿活性并更严格地抑制乙醇途径，在BYSD_PP1背景中缺失PDC5和PDC6，生成菌株BYSD_PP2。这些缺失后，BYSD_PP2在12D → BL方案下的2,3-BDO滴度增加至1.56 g L⁻¹（图1c；见补充材料）。随后将PDC1融合到SULI标签，一种在蓝光下稳定融合蛋白但在黑暗中促进其降解的光开关降解子，在菌株BYSD_p5p6的PDC5Δ PDC6Δ背景中生成菌株BYSD_PS。然而，BYSD_PS在d-only和12 h蓝光后黑暗（12BL → D）方案下均表现出严重生长抑制（见补充材料）。这些结果表明SULI介导的PDC1调控在测试的遗传背景和光照条件下不适用。作为替代，将SULI标签融合到2,3-BDO脱氢酶（BDH1），生成菌株BYSD_BS。在d-only和持续蓝光（l-only）下，BYSD_BS分别产生0.59 g L⁻¹和0.99 g L⁻¹ 2,3-BDO（图1d）。蓝光下较高的2,3-BDO滴度表明SULI模块对BDH1的光依赖性稳定增强了2,3-BDO生产。最后，检查了乙偶姻积累。72 h发酵后，对照菌株BYSD积累0.53 g L⁻¹乙偶姻，而BYSD_BS和BYSD_PP2中乙偶姻浓度分别降至0.25 g L⁻¹和0.10 g L⁻¹（图1e）。结合图1c和d中相应的2,3-BDO滴度，BYSD_BS中较低的乙偶姻浓度与增强的BDH1介导的乙偶姻向2,3-BDO转化一致，而BYSD_PP2中更显著的下降表明竞争性乙醇途径的抑制促进了碳分配向2,3-BDO生物合成。
【数据】菌株：BY4742、BYSD、BYSD_PP1、BYSD_PP2、BYSD_PS、BYSD_BS；BYSD 2,3-BDO：0.54 g L⁻¹（72 h）；BYSD_PP1：d-only 0.57 g L⁻¹，12D→BL 0.79 g L⁻¹；BYSD_PP2：12D→BL 1.56 g L⁻¹；BYSD_BS：d-only 0.59 g L⁻¹，l-only 0.99 g L⁻¹；乙偶姻：BYSD 0.53 g L⁻¹，BYSD_BS 0.25 g L⁻¹，BYSD_PP2 0.10 g L⁻¹；发酵时间：72 h；黑暗预培养：12 h
3.2 通过双模式光遗传调控组合优化碳通量分配
鉴于第3.1节中通过单独调控乙醇和2,3-BDO途径实现的显著滴度提升，实施了同时利用光敏蛋白降解和稳定模块的组合策略以同时控制这些竞争途径。为此，构建了菌株BYSD_BSPP。该菌株结合了BYSD_PP2的PDC1-psd模块和PDC5/PDC6缺失与BYSD_BS的BDH1-SULI模块。表征显示，在d-only和12D → BL方案下，BYSD_BSPP分别产生1.12 g L⁻¹和1.90 g L⁻¹的2,3-BDO。在12D → BL方案下，72 h的2,3-BDO滴度和生物量归一化2,3-BDO产量分别是BYSD相应值的3.52倍和8.79倍（图2a、b）。这些改善与代谢资源更多分配至2,3-BDO生产一致。然而，限制通过PDC节点的通量预计会减少乙醛向乙醇脱氢酶反应的供应，可能限制胞质NAD⁺再生并导致胞内NADH积累。为评估提出的氧化还原限制，使用ecYeast8基因组规模代谢模型模拟BYSD_BSPP在d-only和12D → BL条件下的胞内通量分布（图2c）。在d-only条件下，约76%的归一化碳通量导向乙醇生产，表明乙醇合成作为主要NADH汇，而流向2,3-BDO的通量可忽略。在12D → BL方案下，预测乙醇通量降至40%，同时流向2,3-BDO合成的通量增加。同时，归一化甘油通量从6%增加至46%，代表7.67倍增加。由于甘油生物合成消耗NADH，甘油通量升高表明甘油途径作为替代氧化还原汇消散过量还原当量。总体而言，通量分析表明尽管双光遗传调控促进了碳向2,3-BDO的重新分配，过量NADH仍是进一步通量重新分配的主要限制。这些结果促使在BYSD_BSPP中增强NADH氧化。为确定增强NADH氧化是否能进一步提高2,3-BDO产量，评估了来自副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌168、乳酸乳球菌和罗伊氏粘液乳杆菌的NADH氧化酶基因。使用pYES2L_SD载体构建相应表达质粒并分别引入BYSD_BSPP。在候选菌株中，携带来自副干酪乳杆菌LPnox2的BYSD_BSPPnox2产生最高的2,3-BDO滴度（图2d）。在12D → BL条件下培养72 h后，BYSD_BSPPnox2的2,3-BDO滴度达到2.34 g L⁻¹，相对于对照菌株BYSD_BSPP增加23.16%。这一改善表明增强NADH氧化促进了碳通量向2,3-BDO生物合成，支持了代谢通量分析的预测。
【数据】菌株：BYSD_BSPP、BYSD_BSPPnox2；BYSD_BSPP：d-only 1.12 g L⁻¹，12D→BL 1.90 g L⁻¹；滴度比BYSD高3.52倍，生物量归一化产量高8.79倍；通量分布（d-only）：乙醇76%，甘油6%；通量分布（12D→BL）：乙醇40%，甘油46%（7.67倍增加）；BYSD_BSPPnox2：12D→BL 2.34 g L⁻¹（72 h），比BYSD_BSPP增加23.16%；NADH氧化酶来源：副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌168、乳酸乳球菌、罗伊氏粘液乳杆菌
3.3 通过动态光照策略平衡细胞生长与2,3-BDO合成
第3.2节建立的12D → BL方案用作菌株BYSD_BSPPnox2的基线条件。碳利用分析显示，总葡萄糖的70.86%在初始黑暗阶段被消耗（图3a），留给后续光照阶段2,3-BDO生物合成的碳有限。这种不成比例的消耗意味着只有一小部分……
【数据】菌株：BYSD_BSPPnox2；基线方案：12D→BL；初始黑暗阶段葡萄糖消耗：70.86%；原文未详述后续具体数据
讨论与解读
本研究开发了基于蛋白稳定性的光遗传策略，动态协调酿酒酵母细胞生长与2,3-BDO生产。PDC1和BDH1的互补调控将碳通量从乙醇形成重定向至2,3-BDO生物合成。代谢通量分析表明乙醇形成抑制施加了额外氧化还原约束，异源NADH氧化酶表达部分缓解了该约束。诱导时机、周期性光照和阶段依赖性光照方案的经验优化将2,3-BDO滴度提高至3.27 g L⁻¹。实验数据集与卷积神经网络和差分进化算法的整合进一步识别了动态光照序列，将滴度提高至3.78 g L⁻¹。在5-L光生物反应器中，生物量归一化光子递送结合培养基补充和补料分批培养将2,3-BDO滴度提高至23.95 g L⁻¹。总体而言，整合翻译后光遗传调控、氧化还原工程、数据驱动光照优化和生物量响应光递送，为微生物生物生产的动态控制和放大提供了有前景的框架。
编译者解读：该研究的方法论价值在于将光遗传开关从"概念验证"推进到"可优化系统"——通过CNN-DE框架将光照参数空间从经验试错转变为数据驱动的自动搜索，这一范式可迁移至其他光控代谢回路。双模块设计（psd降解+SULI稳定）实现了对竞争途径的正交调控，但SULI-PDC1组合导致生长抑制，提示光开关与宿主遗传背景的适配仍需个案优化。5-L反应器中23.95 g L⁻¹的产量虽展示了放大可行性，但光生物反应器的光子传递效率与成本仍是规模化瓶颈。NADH氧化酶的引入揭示了氧化还原平衡在光控代谢工程中的关键角色，这一发现对高还原度产物的合成具有普遍参考意义。
参考来源
期刊：Bioresource Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135765
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135765