来源：High endophytic fungal diversity and the antagonistic Aspergillus niger Bzrh13 are associated with Atractylodes macrocephala root rot resistance（Industrial Crops and Products）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
根腐病严重制约名贵药用植物白术的可持续栽培，但其内生真菌群落与抗病性之间的关系长期缺乏系统解析。本研究整合ITS扩增子测序与可培养方法，对安徽三大产区健康与患病白术根茎的真菌组进行比较，发现健康根茎真菌丰富度和多样性显著更高，镰刀菌属在患病根茎中占据主导，而曲霉属、枝孢属和梗孢酵母属是健康根茎的核心内生菌。其中，黑曲霉Bzrh13在离体根茎和盆栽植株中均能显著抑制禾谷镰刀菌引起的根腐病，并通过转录组分析揭示其可下调三种镰刀菌毒素的生物合成基因。
研究背景
白术（Atractylodes macrocephala Koidz.）是我国大宗传统药用植物，其干燥根茎以调节胃肠功能、增强免疫等药理活性著称，是200余种中成药的核心原料。安徽是白术核心产区之一，年干根茎产量超过18000吨，拥有亳州（“亳术”）、祁门（“祁术”）和潜山（“舒术”）三大主产地。近年来根腐病持续威胁白术生产，该病被称为“植物癌症”，可造成产量与药材质量的双重损失。病原菌直接侵染药用根茎并产生真菌毒素，严重降低药材安全性。尽管内生真菌在植物健康中的作用已被广泛认可，但白术根腐病相关的内生真菌群落特征及其与抗病性的关联尚不清楚。本研究通过扩增子测序与功能验证相结合的策略，系统解析内生真菌在白术根腐病抗性中的角色。
研究方法
2.1 田间调查与样品采集
植物样品采自安徽省三个农业生态特征不同的区域：亳州市（BZ，俗称“亳术”，33°41′33″N，116°30′12″E；暖温带平原）、潜山县（QS，俗称“舒术”，30°48′34″N，116°16′17″E；亚热带丘陵区）和祁门县（QM，俗称“祁术”，29°58′37″N，117°16′14″E；亚热带山区）（补充图S1A、表S1）。白术种植于这些区域的露天农田中，田间栽培设置如补充图S1B所示。采样时进行了初步田间调查以评估根腐病严重度，结果显示三个区域间差异显著，病情指数以QS最高（52.3%），其次为BZ（28.6%）和QM（5.7%）（补充表S1，分级标准见补充表S2）。基于这些结果，从每个地点采集代表性患病和健康植株（补充图S1C-H）。2023年10月（花期），每个地点采集5株症状健康植株和5株患病植株（n = 5重复/组），同时采集每个地点的根际土壤。采集后，将一部分表现早期根腐病症状的受感染根茎保存在25 ± 2℃室温下用于症状观察，期间病害从早期菌丝附着发展到晚期菌丝消失，通过切片内部检查发现显著根腐（补充图S2）。根据区域病害严重度和实验目的，将采集样品分配至不同下游分析，汇总于补充表S1。采集样品包括六个根茎组（QSRH、QSRD、QMRH、QMRD、BZRH、BZRD）及每个地点对应的根际土壤（SD），其中前两个字母表示地点（QS：潜山，QM：祁门，BZ：亳州），RH和RD分别表示健康与患病根茎。所有样品采集后立即放入无菌聚乙烯袋中并运回实验室。样品用途如下：所有六个根茎组用于高通量测序分析；两个患病根茎组（QSRD和BZRD）及患病“舒术”根际土壤（QSSD）用于病原真菌分离；健康根茎组QMRH和BZRH用于白术内生真菌分离。根茎样品进行常规表面消毒，包括浸入75%乙醇（v/v）1 min，随后浸入5%次氯酸钠（w/v）1 min，然后用无菌水冲洗5次、每次30 s。通过将100 μL最终冲洗液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板并在25°C培养48 h验证无菌性。平板上无细菌或真菌菌落表明表面消毒成功。仅消毒成功的根茎样品用于宏基因组DNA提取和真菌分离。
【数据】采样地点：亳州BZ（33°41′33″N，116°30′12″E）、潜山QS（30°48′34″N，116°16′17″E）、祁门QM（29°58′37″N，117°16′14″E）；采样时间：2023年10月花期；病情指数：QS 52.3%、BZ 28.6%、QM 5.7%；每组重复数：n = 5；保存温度：25 ± 2℃；消毒条件：75%乙醇1 min、5%次氯酸钠1 min、无菌水冲洗5次×30 s；消毒验证培养：25°C、48 h；PDA平板冲洗液用量：100 μL
2.2 ITS扩增子测序与生物信息学分析
从每个白术根茎中随机选取10个表面消毒的片段，混合为一个重复，六个根茎组（QSRH、QSRD、QMRH、QMRD、BZRH、BZRD）各设五个生物学重复。表面消毒的根茎组织匀浆后，通过两层纱布过滤去除残渣（You et al., 2025），使用改良的十六烷基三甲基溴化铵法提取总基因组DNA（Xiong et al., 2025）。真菌ITS1区域用引物ITS1F/ITS1R扩增，PCR产物经纯化、建库后在Illumina NovaSeq 6000平台（PE250模式）测序。原始测序数据存入NCBI SRA数据库，生物信息学分析在Wekemo Tech Group平台进行。原始reads经质量过滤、去噪和合并（DADA2，QIIME2），然后以97%序列相似度聚类为操作分类单元（OTUs）。所得OTUs针对UNITE 8.2 99%数据库注释，去除线粒体和叶绿体序列。通过稀释曲线验证测序可靠性，使用Venn图可视化共享/特有OTUs。进行Alpha多样性（Chao1、Shannon、Simpson）和Beta多样性（基于Bray-Curtis距离的主坐标分析PCoA、PERMANOVA）分析，比较健康与患病根茎间真菌群落差异。ANCOM鉴定差异丰度OTUs，LEfSe（LDA > 4.0，Kruskal-Wallis检验α = 0.05）检测组特异性生物标志物，通过Spearman相关分析（FDR校正P < 0.05）构建优势类群（相对丰度 > 1%，存在于 > 50%样品中）的共现网络，并用R和Gephi可视化。
【数据】每个根茎选取片段数：10个；生物学重复：每组5个；OTU聚类相似度：97%；数据库：UNITE 8.2 99%；LEfSe阈值：LDA > 4.0，α = 0.05；共现网络阈值：相对丰度 > 1%，存在于 > 50%样品；Spearman相关：FDR校正P < 0.05；测序平台：Illumina NovaSeq 6000（PE250）
2.3 真菌分离、纯化与物种鉴定
真菌分离物（推定病原真菌和内生真菌）按照我们先前的方法培养（Xu et al., 2019）。内生真菌通过组织分离法从健康根茎（QMRH、BZRH）中分离；推定病原真菌通过组织分离法从患病根茎（QSRD、BZRD）中分离，并通过梯度稀释法从根际土壤（QSSD）中分离（补充表S1）。简言之，表面消毒的白术根茎用无菌手术刀切成1 cm × 0.5 cm × 0.5 cm的小块；每个9 cm直径PDA平板放置5块（间距1 cm，121°C灭菌20 min，添加50 μg/mL硫酸链霉素），在28°C培养10天，每日检查边缘菌落。对于根际土壤分离，将1 g土壤加入装有100 mL无菌水的250 mL锥形瓶中，振荡10 min制备悬浮液，然后从10⁻¹至10⁻⁴进行10倍系列稀释。取各稀释液100 μL涂布于PDA平板，在与上述相同条件下培养。形态学上不同的菌落通过连续三次传代纯化，纯化菌株保存在20%（v/v）甘油中于−80°C。所有分离菌株根据菌落形态（生长速率、颜色、质地）进行初步表征和分组，镰刀菌分离物额外记录分生孢子形态。对于镰刀菌物种，采用两步鉴定策略：首先参照Leslie和Summerell（2006）整合菌落和分生孢子特征进行初步分类，然后通过多位点系统发育分析确认。对于内生真菌，形态特征作为初步筛选和分组的基础；两个核心生防候选菌株（Bzrh1和Bzrh13）通过多位点系统发育分析准确鉴定到种水平，其余内生菌株通过单一位点ITS测序鉴定，形态特征作为辅助验证。对于分子鉴定，所有菌株的基因组DNA从刮取菌丝中使用Qiagen DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，德国）按制造商方案提取。对于镰刀菌菌株，ITS、RPB2和TEF-α位点用位点特异性引物PCR扩增（Chu et al., 2025; Jiang et al., 2025），条件如下：95°C预变性5 min；35个循环的95°C变性（30 s）、52–60°C位点特异性退火（30 s）和72°C延伸（1 min）；最后72°C延伸10 min。对于内生真菌，所有菌株扩增ITS基因，两个需要种水平分辨率的核心生防菌株额外扩增其他基因（Bzrh1的TEF和ACT；Bzrh13的RPB2和CaM）。所有扩增子进行Sanger测序（Sangon Biotech，中国）。对于多位点系统发育分析，每个位点的contig经过组装……
【数据】根茎切块尺寸：1 cm × 0.5 cm × 0.5 cm；每皿放置：5块；间距：1 cm；PDA灭菌：121°C、20 min；链霉素浓度：50 μg/mL；培养温度：28°C；培养时间：10天；土壤用量：1 g；无菌水体积：100 mL；振荡时间：10 min；稀释梯度：10⁻¹至10⁻⁴；涂布量：100 μL；纯化传代：3次；保存甘油浓度：20%（v/v）；保存温度：−80°C；PCR预变性：95°C、5 min；循环数：35；变性：95°C、30 s；退火：52–60°C、30 s；延伸：72°C、1 min；最终延伸：72°C、10 min
研究结果
3.1 健康和患病白术根茎的真菌微生物群差异显著：健康样品中丰富度和Alpha多样性指数更高
经质量控制和过滤后，从“舒术”、“祁术”和“亳术”产区样品中分别获得931,646、1,536,617和923,594条高质量ITS序列（补充表S3）。所有稀释曲线趋于平台期，表明达到了合理的测序深度（补充图S3）。Venn图展示了三个区域健康和患病根茎间真菌OTUs的分布。在“舒术”中，患病和健康根茎共享103个OTUs，患病根茎特有269个，健康根茎特有396个；在“祁术”中，共享113个OTUs，患病特有301个，健康特有1058个；在“亳术”中，共享71个OTUs，患病特有250个，健康特有812个（补充图S4）。总OTUs显示健康根茎真菌丰富度更高：“舒术”健康499个OTUs vs 患病372个，“祁术”健康1171个OTUs vs 患病414个，“亳术”健康883个OTUs vs 患病321个（补充表S4）。三个产区健康与患病根茎中观察到的特有OTUs数量呈现类似趋势。Alpha多样性分析显示，三个产区健康根茎的真菌多样性均显著高于患病根茎（图1 A–F；补充图S5；补充表S5）。在“舒术”中，健康根茎（QSRH）的Chao1（153.83 vs 119.00，P < 0.05）和Simpson（0.86 vs 0.82，P < 0.05）指数显著高于患病根茎（QSRD），但Shannon指数在两组间无显著差异（3.80 vs 3.63，P > 0.05）。然而在“祁术”和“亳术”中，健康根茎所有三个指数均显著高于患病根茎（“祁术”：Chao1 341.80 vs 135.20，Shannon 5.09 vs 2.91，Simpson 0.91 vs 0.74，均P < 0.01；“亳术”：Chao1 292.2 vs 83.8，Shannon 8.71 vs 1.68，Simpson 0.96 vs 0.44，均P < 0.01）。总体而言，健康根茎的Alpha多样性值比患病根茎高1.5–2.0倍。Beta多样性分析中，PCoA结果显示三个产区健康和患病样品的真菌群落明显分离，“舒术”中PCoA1解释55.5%、PCoA2解释23.2%的总变异（图1G），“祁术”中PCoA1占53%、PCoA2占14.4%（图1H），“亳术”中PCoA1代表71%、PCoA2代表11.2%（图1I）。此外，PERMANOVA验证了各区域内健康和患病根茎间群落结构的显著差异：“舒术”（P = 0.009，R² = 0.25）、“祁术”（P = 0.005，R² = 0.32）和“亳术”（P = 0.003，R² = 0.28），表明根茎健康状态解释了真菌群落结构变异的25%–32%。
【数据】高质量ITS序列数：舒术931,646条、祁术1,536,617条、亳术923,594条；共享OTUs：舒术103、祁术113、亳术71；健康特有OTUs：舒术396、祁术1058、亳术812；患病特有OTUs：舒术269、祁术301、亳术250；总OTUs：舒术健康499 vs 患病372、祁术健康1171 vs 患病414、亳术健康883 vs 患病321；Chao1：舒术153.83 vs 119.00（P < 0.05）、祁术341.80 vs 135.20（P < 0.01）、亳术292.2 vs 83.8（P < 0.01）；Shannon：舒术3.80 vs 3.63（P > 0.05）、祁术5.09 vs 2.91（P < 0.01）、亳术8.71 vs 1.68（P < 0.01）；Simpson：舒术0.86 vs 0.82（P < 0.05）、祁术0.91 vs 0.74（P < 0.01）、亳术0.96 vs 0.44（P < 0.01）；PCoA：舒术PCoA1 55.5%、PCoA2 23.2%，祁术PCoA1 53%、PCoA2 14.4%，亳术PCoA1 71%、PCoA2 11.2%；PERMANOVA：舒术P = 0.009、R² = 0.25，祁术P = 0.005、R² = 0.32，亳术P = 0.003、R² = 0.28
3.2 白术根茎核心真菌组成显著变化：镰刀菌属主导患病根茎，曲霉属/枝孢属构成健康根茎核心属
在门水平上，子囊菌门是所有根茎中的优势门，而担子菌门在三个区域均从健康样品到患病样品呈下降趋势（图2 A–C）。在属水平上，健康和患病根茎间出现了更显著的差异。镰刀菌属主导患病根茎，相对丰度为23.5%–87.0%，表明其在患病根茎中的丰度是健康根茎（0.6%–8.0%）的3.2–145倍。相反，曲霉属丰度在患病根茎中急剧下降：从健康“舒术”的43.4%降至患病“舒术”的8.8%；健康“祁术”的9.7%降至患病“祁术”的0.5%；健康“亳术”的19.0%降至患病“亳术”的0.1%。其他相对丰度大于1%的属包括篮状菌属、枝孢属、梗孢酵母属和节担菌属（图2 D–F及补充表S6）。LEfSe分析进一步鉴定镰刀菌属为潜在病害生物标志物，具有高LDA评分（患病“亳术”5.724、患病“舒术”5.516、患病“祁术”4.956）。相比之下，曲霉属（健康“舒术”LDA = 5.657、健康“亳术”LDA = 5.386）、枝孢属（健康“祁术”LDA = 5.148、健康“亳术”LDA = 5.071）和梗孢酵母属（健康“舒术”LDA = 5.482、健康“祁术”LDA = 5.347）被鉴定为健康根茎中富集的核心属（图2 G-I；补充图S6；补充表S7）。这些结果清楚表明健康和患病白术根茎间真菌群落组成存在显著差异。
【数据】镰刀菌属相对丰度：患病根茎23.5%–87.0%，健康根茎0.6%–8.0%，患病/健康倍数3.2–145倍；曲霉属丰度：舒术健康43.4%→患病8.8%，祁术健康9.7%→患病0.5%，亳术健康19.0%→患病0.1%；LDA评分：镰刀菌属患病亳术5.724、患病舒术5.516、患病祁术4.956；曲霉属健康舒术5.657、健康亳术5.386；枝孢属健康祁术5.148、健康亳术5.071；梗孢酵母属健康舒术5.482、健康祁术5.347
3.3 共现网络揭示镰刀菌属与曲霉属/枝孢属间一致的负相关关系
这些拮抗关系得到共现网络分析的进一步支持。“舒术”、“祁术”和“亳术”的网络分别包含50个节点393条边（密度 = 0.32）、48个节点522条边（密度 = 0.46）和47个节点467条边（密度 = 0.43）。其中，“祁术”网络表现出最高的密度和平均度（每节点11.8个连接），表明其物种互作强于其他两个网络（补充表S8）。结构复杂性排序为“祁术”（最复杂）> “亳术”> “舒术”（最简单）。在所有三个网络中，镰刀菌属始终与曲霉属和枝孢属呈显著负相关（Spearman's r < −0.6，校正P < 0.05）。具体而言，在“舒术”网络中，镰刀菌属与曲霉属/枝孢属的相关系数分别为−0.606/−0.672；在“祁术”中为−0.842/−0.818；在“亳术”中为−0.679/−0.688（图2J；补充表S8）。“祁术”网络还显示镰刀菌属与梗孢酵母属、节担菌属、链格孢属、黏帚霉属、Cutaneotrichosporon和木霉属之间的密集连接，而“亳术”网络则以镰刀菌属与曲霉属或枝孢属之间的强负相关为特征，同时伴有镰刀菌属、Cutaneotrichosporon和梗孢酵母属之间的连接。
【数据】网络参数：舒术50节点393边（密度0.32）、祁术48节点522边（密度0.46）、亳术47节点467边（密度0.43）；祁术平均度：11.8连接/节点；Spearman相关系数：舒术镰刀菌-曲霉−0.606、镰刀菌-枝孢−0.672；祁术镰刀菌-曲霉−0.842、镰刀菌-枝孢−0.818；亳术镰刀菌-曲霉−0.679、镰刀菌-枝孢−0.688；显著性阈值：r < −0.6，校正P < 0.05
3.4 禾谷镰刀菌Qssd1和尖孢镰刀菌Qsrd11在离体根茎和盆栽植株中表现出高致病性
本研究从患病白术根茎和根际土壤中分离出28株推定病原菌株。通过形态学和分子方法相结合对这些分离物进行物种鉴定（补充表S9）：分离物的菌落形态和初步ITS分类结果见补充图S7。这28株分离物被归类为11个属。其中，14株（占分离物总数的50%）被鉴定为镰刀菌属物种。这些真菌属的分布，特别是镰刀菌属物种的高比例，与高通量测序结果一致（补充图S7、表S9）。为验证微生物组中的优势属——镰刀菌属是否作为主要病原真菌，对镰刀菌属和其他候选属进行了致病性测定。作为对其致病潜力的初步评估，通过将这些菌株接种到白术根茎上进行离体组织侵染试验。7天后，观察到不同程度的根腐症状。病斑面积定量显示以下结果：菌株Qssd1、Qsrd7、Qsrd11、Qsrd16和Bzrd2的病斑面积分别为28.83 ± 3.25 mm²、22.17 ± 2.91 mm²、27.5 ± 1.68 mm²、21.6 ± 3.20 mm²和21.67 ± 6.30 mm²（图3 A–B，P < 0.05）。这些菌株产生的病斑显著大于大多数其他菌株。相比之下，菌株Qsrd6的病斑面积（19.50 ± 0.82 mm²）小于其他菌株。这些结果证实所测试的菌株……
【数据】分离菌株总数：28株；归类属数：11个属；镰刀菌属菌株数：14株（占50%）；离体接种时间：7天；病斑面积：Qssd1 28.83 ± 3.25 mm²、Qsrd7 22.17 ± 2.91 mm²、Qsrd11 27.5 ± 1.68 mm²、Qsrd16 21.6 ± 3.20 mm²、Bzrd2 21.67 ± 6.30 mm²、Qsrd6 19.50 ± 0.82 mm²；显著性：P < 0.05
讨论与解读
根腐病严重制约白术可持续栽培，其发生与高温高湿、排水不良等环境因素及连作等农艺措施相关。根际微生物组被广泛认为有助于植物抗病性，但白术内生真菌群落与根腐病发生的关系此前尚不清晰。本研究通过扩增子分析与功能验证相结合，解析了内生真菌在根腐病抗性中的作用。镰刀菌属是广泛分布于子囊菌门的病原属，已知可引起植物根腐并产生真菌毒素，在三个采样区域的白术患病根茎中均显著富集。该属被报道可通过降解宿主细胞壁和分泌毒力因子促进病害进展，也可能导致微生物群落失调。这一发现得到可培养结果的印证：28株分离病原菌中50%属于镰刀菌属，与高通量测序数据一致，强化了其在致病中的主导地位。禾谷镰刀菌和尖孢镰刀菌被鉴定为主要致病因子，拓展了先前的研究发现。健康根茎中曲霉属、枝孢属和梗孢酵母属的富集，以及它们与镰刀菌属的显著负相关，提示这些核心内生菌可能通过拮抗作用参与病害抑制。黑曲霉Bzrh13在离体和盆栽条件下均表现出显著生防效果，转录组分析进一步揭示其可下调禾谷镰刀菌中三种真菌毒素（金镰刀菌素、玉米赤霉烯酮和镰刀菌素H）的生物合成关键基因，qRT-PCR验证了这些结果。本研究为白术根腐病的微生物管理策略开发提供了初步实验依据。
编译者解读：该研究将群落生态学描述与可培养功能验证相结合，从田间病害调查到菌株分离、致病性测定、生防评价和转录组机制解析，形成了一条较为完整的证据链。黑曲霉Bzrh13作为生防菌株，其发酵上清液即可有效抑制病原菌，显示出开发为微生物制剂的潜力。但研究目前停留在实验室和盆栽水平，田间大规模防控效果、菌株定殖能力及制剂稳定性仍需验证。此外，转录组仅揭示了毒素合成基因的下调，具体的拮抗活性物质和分子互作机制尚未阐明。
参考来源
Min R, et al. High endophytic fungal diversity and the antagonistic Aspergillus niger Bzrh13 are associated with Atractylodes macrocephala root rot resistance. Industrial Crops and Products, 2026.
DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.124264
DOI: 10.1016/j.indcrop.2026.124264