来源：Multi-omics guided engineering of a low-foaming Yarrowia lipolytica for sustainable erythritol production from lignocellulosic hydrolysates（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
赤藓糖醇作为零热量甜味剂市场持续扩大，但工业发酵长期受困于原料成本高和发酵起泡严重两大瓶颈。本研究从高渗环境中筛选到一株天然低产泡的野生解脂耶氏酵母167，建立了基于CRISPR-Cas9的高效基因编辑平台，结合基因组重测序、转录组和代谢组多组学分析揭示了赤藓糖醇合成途径的关键代谢瓶颈，经精准代谢工程改造使赤藓糖醇产量提高2.3倍。最终以小麦秸秆木质纤维素水解液为碳源，在5 L生物反应器中通过补料分批发酵实现赤藓糖醇产量214.2 g/L、得率0.60 g/g、生产率2.23 g/L/h，为目前报道的以木质纤维素水解液生产赤藓糖醇的最高水平。
研究背景
全球健康饮食和减糖需求持续增长，零热量甜味剂市场不断扩张。赤藓糖醇是一种天然存在的四碳糖醇，具有零热量、高甜度、不致龋齿和血糖中性等特性，其代谢不依赖胰岛素，可经肾脏直接排出，是糖尿病患者的理想糖替代品，已获美国FDA的GRAS认证。因此，开发高效、经济、可持续的赤藓糖醇生物生产技术成为研究重点。
目前工业赤藓糖醇生产主要依赖微生物发酵，解脂耶氏酵母因其独特的生理代谢优势被认为是理想底盘。该酵母能高效利用多种低成本碳源，包括葡萄糖、甘油（含粗甘油）、脂肪酸和废弃食用油。然而，工业发酵中严重的起泡问题显著增加了过程控制难度和运营成本，同时原料成本居高不下。本研究旨在筛选天然低产泡的赤藓糖醇生产菌株，建立遗传操作平台，通过多组学指导的代谢工程提升产量，并验证其利用木质纤维素水解液生产赤藓糖醇的能力。
研究方法
2.1 培养条件与培养基
LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，用于大肠杆菌培养。YPD固体培养基：葡萄糖20 g/L、酵母提取物10 g/L、胰蛋白胨20 g/L、琼脂20 g/L，用于解脂耶氏酵母培养。合成定义（SD）培养基：无氨基酸酵母氮源6.7 g/L、葡萄糖20 g/L，根据转化体筛选需要补充适当氨基酸或5-氟乳清酸。种子培养基：葡萄糖20 g/L、酵母提取物5 g/L、玉米浆5 g/L、MgSO₄ 0.5 g/L、柠檬酸铵3.5 g/L，用于解脂耶氏酵母发酵种子培养。发酵培养基：葡萄糖300 g/L、酵母提取物5 g/L、玉米浆5 g/L、MgSO₄ 0.5 g/L、柠檬酸铵3.5 g/L，用于赤藓糖醇生产。木质纤维素水解液发酵培养基：50%–60%（v/v）木质纤维素水解液、酵母提取物5 g/L、玉米浆5 g/L、MgSO₄ 0.5 g/L、柠檬酸铵3.5 g/L，用于赤藓糖醇生产。小麦秸秆木质纤维素水解液由苏州普利诺生物科技有限公司提供。粉碎后的小麦秸秆与亚硫酸铵进行水热反应，随后固液分离。固体部分先用半纤维素酶处理以分离和回收木糖，然后加入纤维素酶将高纯度纤维素进一步水解为葡萄糖。最后经浓缩获得秸秆糖液。
【数据】LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L；YPD固体培养基：葡萄糖20 g/L、酵母提取物10 g/L、胰蛋白胨20 g/L、琼脂20 g/L；SD培养基：无氨基酸酵母氮源6.7 g/L、葡萄糖20 g/L；种子培养基：葡萄糖20 g/L、酵母提取物5 g/L、玉米浆5 g/L、MgSO₄ 0.5 g/L、柠檬酸铵3.5 g/L；发酵培养基：葡萄糖300 g/L、酵母提取物5 g/L、玉米浆5 g/L、MgSO₄ 0.5 g/L、柠檬酸铵3.5 g/L；水解液发酵培养基：木质纤维素水解液50%–60%（v/v）、酵母提取物5 g/L、玉米浆5 g/L、MgSO₄ 0.5 g/L、柠檬酸铵3.5 g/L
2.2 质粒与菌株构建
对于基因过表达，从解脂耶氏酵母基因组DNA中扩增目标基因，与酶切后的质粒PINA1312组装构建过表达质粒。线性化表达盒通过醋酸锂转化法导入解脂耶氏酵母细胞，获得过表达菌株。对于基因敲除，将CRISPR-Cas9表达质粒pCAS1yl（携带相应sgRNA序列和Ura3标记）转化至解脂耶氏酵母菌株中，靶向敲除目标基因。本研究所用菌株、质粒和引物列于表S1和表S2（支持信息）。
【数据】质粒：PINA1312（过表达）、pCAS1yl（CRISPR-Cas9）；转化方法：醋酸锂转化法；筛选标记：Ura3；原文未详述sgRNA具体序列
2.3 基因组重测序分析
将解脂耶氏酵母菌株167和F4分别接种于YPD培养基中。培养24 h后，离心收集细胞（4 °C，12000 rpm，10 min），用无菌PBS缓冲液洗涤三次，最后在液氮中快速冷冻。样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行基因组重测序分析。合格文库使用Illumina NovaSeq X Plus™平台测序。数据过滤后进行生物信息学分析，包括单核苷酸多态性（SNPs）和插入/缺失（Indels）的评估。
【数据】菌株：167和F4；培养基：YPD；培养时间：24 h；离心条件：4 °C、12000 rpm、10 min；洗涤液：无菌PBS缓冲液；测序平台：Illumina NovaSeq X Plus™；分析内容：SNPs、Indels
2.4 转录组学分析
将解脂耶氏酵母菌株167和F4分别接种于发酵培养基中。培养48 h后，离心收集细胞（4 °C，12000 rpm，10 min），用无菌PBS缓冲液洗涤三次，最后在液氮中快速冷冻。样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行转录组测序分析（Nie et al., 2025）。基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体论（GO）公共数据库进行注释分类和富集分析。
【数据】菌株：167和F4；培养基：发酵培养基；培养时间：48 h；离心条件：4 °C、12000 rpm、10 min；洗涤液：无菌PBS缓冲液；数据库：KEGG、GO
2.5 代谢组学分析
将解脂耶氏酵母菌株167和F4分别接种于发酵培养基中。培养48 h后，离心收集细胞（4 °C，12000 rpm，10 min），用无菌PBS缓冲液洗涤三次，最后在液氮中快速冷冻并储存于-80 °C用于代谢组学分析。代谢组学分析使用多组学平台结合液相色谱-串联质谱（LC-MS）进行。数据分析使用KEGG和人类代谢组数据库（HMDB）。
【数据】菌株：167和F4；培养基：发酵培养基；培养时间：48 h；离心条件：4 °C、12000 rpm、10 min；储存温度：-80 °C；分析平台：LC-MS；数据库：KEGG、HMDB
2.6 摇瓶与5 L生物反应器发酵
对于摇瓶发酵，将YPD平板上活化48 h的单菌落接种至50 mL种子培养基中，在30 °C、220 rpm条件下培养24 h。种子培养物以2%（v/v）接种量转接至含50 mL发酵培养基的挡板摇瓶中，在30 °C、220 rpm、自然pH条件下发酵96 h。发酵过程中以低剂量间歇性添加消泡剂，以尽量减少其对细胞的生理影响。对于生物反应器发酵，将制备好的种子培养物以2%（v/v）接种量转接至含2 L发酵培养基的5 L生物反应器中。发酵温度为30 °C，搅拌转速500 rpm，通气量2 vvm，过程中不调节pH。
【数据】摇瓶发酵：种子培养24 h、30 °C、220 rpm；接种量2%（v/v）；发酵体积50 mL；发酵条件30 °C、220 rpm、自然pH、96 h；生物反应器：5 L规模、装液量2 L、温度30 °C、搅拌500 rpm、通气2 vvm、不调pH
2.7 荧光强度表征
收集的细胞用PBS洗涤两次并重悬。使用SpectraMax i3x酶标仪（Molecular Devices，Sunnyvale，NY，USA）测定600 nm处光密度和荧光强度（激发波长485 nm，发射波长528 nm）。为进行比较分析，荧光强度值归一化为相对强度值（Kang et al., 2025）。
【数据】洗涤液：PBS；洗涤次数：2次；激发波长：485 nm；发射波长：528 nm；仪器：SpectraMax i3x酶标仪
2.8 分析方法
使用INESA 722N紫外-可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）测定OD600。使用M-100生物传感器分析仪（深圳希曼科技有限公司）测定残余葡萄糖浓度。为检测赤藓糖醇浓度，使用HPLC分析（Waters e2695-Empower系统；Waters Corporation，Milford，MA，USA），以2.5 mM硫酸为流动相，流速0.6 mL/min（Li et al., 2025）。
【数据】OD600仪器：INESA 722N紫外-可见分光光度计；葡萄糖测定：M-100生物传感器分析仪；HPLC系统：Waters e2695-Empower；流动相：2.5 mM硫酸；流速：0.6 mL/min
2.9 统计分析
所有发酵均进行三次独立生物学重复（n = 3）。统计学显著性采用双尾Student's t检验确定。p值 < 0.05认为具有统计学显著性（ p < 0.05， p < 0.01， p < 0.001，ns表示无显著差异）。
【数据】重复数：n = 3；统计方法：双尾Student's t检验；显著性阈值：p < 0.05
研究结果
3.1 非起泡解脂耶氏酵母菌株167的发酵特性
解脂耶氏酵母167是一株从高渗环境中分离的野生型赤藓糖醇生产菌株，其最显著的特征是发酵过程中不产生泡沫（Nie et al., 2025）。为系统评估其发酵性能，本研究与另一株具有高赤藓糖醇生产能力但起泡严重的野生型菌株F4进行了平行比较。如图1a和1b所示，在相同发酵条件下，菌株167几乎不产生可见泡沫，而菌株F4则表现出剧烈起泡。
进一步分析了两种菌株在添加和不添加化学消泡剂条件下的细胞生长和产物合成情况。发酵96 h后，菌株F4在不添加消泡剂条件下OD600和赤藓糖醇产量分别显著下降39.0%和40.1%（图1c和1d）。相比之下，菌株167在无消泡剂条件下OD600仅小幅下降（8.2%），其赤藓糖醇产量保持稳定，消泡剂添加组与无消泡剂组之间无统计学显著差异（Student's t检验，p > 0.05）。这些结果表明，过度泡沫形成严重抑制解脂耶氏酵母的细胞生长并损害其生产性能（Mirończuk et al., 2019）。同时，菌株167固有的低产泡表型使其无需外部消泡干预即可维持高效赤藓糖醇合成。这凸显了其在简化发酵工艺和降低成本方面的工业潜力。
【数据】菌株：167和F4；发酵时间：96 h；F4无消泡剂OD600下降：39.0%；F4无消泡剂赤藓糖醇产量下降：40.1%；167无消泡剂OD600下降：8.2%；167赤藓糖醇产量差异：无统计学显著性（p > 0.05）
3.2 基于解脂耶氏酵母167的工程底盘菌株构建
解脂耶氏酵母167因其固有的低产泡特性在工业应用中具有相当大的前景。然而，其相对较低的赤藓糖醇产量限制了直接应用的潜力。此外，由于野生型菌株普遍缺乏高效的遗传操作工具，通过代谢工程提升其生产能力面临挑战（Yang et al., 2022）。因此，本研究首先聚焦于为菌株167建立合适的选择标记和基因编辑系统。
#### 3.2.1 基于NHEJ修复机制的CRISPR-Cas9基因编辑系统构建
尿嘧啶营养缺陷型是酵母遗传操作中最常用的选择标记之一。该标记基于Ura3基因，其编码乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶，是尿嘧啶生物合成途径的关键酶。因此，Ura3基因的缺失使菌株无法在缺乏尿嘧啶的培养基上生长，从而可作为正向选择标记（图2a和2b）（Huang et al., 2023）。此外，Ura3基因的产物将5-氟乳清酸（5-FOA）转化为毒性化合物5-氟尿嘧啶。该代谢物掺入RNA后干扰正常转录，导致细胞死亡（图2c）。基于这一特性，Ura3标记也可用于反向筛选：在含5-FOA的平板上，只有丢失Ura3基因的菌株才能存活（图2d）。利用这一原理，我们构建了包含Ura3基因侧翼1000 bp同源臂的敲除盒，并尝试在补充5-FOA的SD平板上筛选正确突变体（图2e）。然而，未能获得预期菌株。这一失败可能归因于解脂耶氏酵母倾向于通过非同源末端连接（NHEJ）而非同源重组（HR）修复双链断裂，使得利用HR进行基因组编辑困难（Bae et al., 2019; Galli et al., 2018）。
为提高编辑效率，我们随后采用了基于NHEJ修复机制的CRISPR-Cas9系统。在该系统中，Ura3基因被破坏的突变体能够在含5-FOA的培养基上形成单菌落，但无法在缺乏尿嘧啶的基本培养基上生长。我们设计了靶向Ura3基因的sgRNA并将其克隆至pCAS1yl质粒中，获得重组质粒pCAS1yl-Ura3。将该质粒转化至野生型菌株167后，在选择性平板上成功获得单菌落。随后挑取单菌落分别划线至含5-FOA的平板和尿嘧啶缺乏平板上。菌株在含5-FOA平板上正常生长，但在尿嘧啶缺乏平板上无法生长，表明Ura3成功被破坏，获得菌株YL167-01（图2f）。测序分析显示，使用基于NHEJ的CRISPR-Cas9系统敲除Ura3并未导致整个基因的完全缺失，而是在sgRNA靶位点附近诱导了小片段随机突变，从而引起移码突变使基因失活（图2g）。这些结果成功建立了基于CRISPR-Cas9/NHEJ的基因敲除方法。
【数据】同源臂长度：1000 bp；筛选平板：SD + 5-FOA；质粒：pCAS1yl-Ura3；菌株：YL167-01；突变类型：sgRNA靶位点附近小片段随机突变导致移码；未获得同源重组突变体
#### 3.2.2 适用于多轮编辑的选择标记系统构建
为实现连续多轮基因组编辑，随后引入潮霉素B作为额外的选择标记。为确保严格筛选，测定了底盘菌株对潮霉素B的敏感性以确定最佳筛选浓度。将活化后的Po1f（模式菌株）和菌株167分别涂布于含0至600 μg/mL潮霉素B浓度范围的YPD平板上。结果表明，菌株167在潮霉素B浓度为400 μg/mL时生长完全被抑制，而Po1f在300 μg/mL时完全被抑制（图S1）。因此，确定400 μg/mL为解脂耶氏酵母167潮霉素抗性筛选的最佳工作浓度。该浓度可有效减少假阳性转化体，同时避免过高抗生素浓度引起的额外细胞应激或非特异性抑制。值得注意的是，野生型菌株167对潮霉素的耐受性显著高于实验室模式菌株Po1f，表明其具有更强的固有鲁棒性。
为评估所构建底盘菌株的蛋白表达能力和筛选系统的可靠性，将组成型强启动子hp4d驱动的绿色荧光蛋白（hrGFP）表达盒导入YL167-01（图3a）。从尿嘧啶缺乏培养基上随机选取10个单菌落进行PCR验证，均获得预期大小的特异性条带，证实了基于尿嘧啶营养缺陷型标记系统的严格筛选效率。验证正确的重组菌株命名为YL167-02（图3a）。荧光强度测定显示，与未转化荧光蛋白的对照菌株（YL167-01）相比，重组菌株YL167-02表现出显著的绿色荧光信号，表明报告基因成功表达（图3c）。
为进一步验证该系统用于连续遗传操作的潜力，将携带潮霉素抗性标记的hrGFP表达盒导入YL167-02，获得菌株YL167-03（图3b）。定量荧光分析显示，YL167-03的平均荧光强度为379255.75，显著高于YL167-02（约1.83倍）（图3c），表明该表达系统允许外源基因的迭代整合，且后续整合可增强表达能力。在发酵培养基高葡萄糖浓度下监测了重组菌株荧光蛋白表达的时间进程。结果显示，荧光强度在发酵初期逐渐增加，在48 h达到峰值，约为……
【数据】潮霉素B筛选浓度：菌株167为400 μg/mL、Po1f为300 μg/mL；PCR验证单菌落数：10个；YL167-03平均荧光强度：379255.75；YL167-03较YL167-02荧光强度倍数：约1.83倍；荧光峰值时间：48 h
3.3 菌株167与F4的多组学分析
（注：原文节选未提供3.3节完整内容，以下基于摘要及讨论部分信息整理。）
通过整合基因组重测序、比较转录组学和代谢组学分析，系统阐明了菌株167中赤藓糖醇生物合成途径的关键代谢瓶颈。多组学分析揭示了包括磷酸戊糖途径通量不足、赤藓糖醇降解途径活跃以及菌丝细胞形态等代谢瓶颈。
【数据】组学类型：基因组重测序、转录组学、代谢组学；分析对象：菌株167和F4；原文未详述具体差异基因数和代谢物数
3.4 代谢工程与发酵验证
基于多组学分析提供的机制见解，对菌株167进行了精准代谢工程改造，赤藓糖醇产量提高2.3倍。改造策略包括阻断降解途径、形态工程和关键代谢靶点过表达。
随后，以小麦秸秆木质纤维素水解液作为替代碳源，在5 L生物反应器中进行补料分批发酵，工程菌株实现了赤藓糖醇产量214.2 g/L、得率0.60 g/g和生产率2.23 g/L/h。这是目前报道的解脂耶氏酵母以木质纤维素水解液生产赤藓糖醇的最高水平。
【数据】赤藓糖醇产量提升倍数：2.3倍；生物反应器规模：5 L；碳源：小麦秸秆木质纤维素水解液；发酵方式：补料分批；产量：214.2 g/L；得率：0.60 g/g；生产率：2.23 g/L/h
讨论与解读
本研究针对工业赤藓糖醇生产的两大关键挑战——发酵泡沫控制和原料成本——构建了一株解脂耶氏酵母工程菌株。通过系统的代谢工程改造，该菌株兼具低产泡特性和高效木质纤维素利用能力。研究筛选到天然低产泡野生菌株167，建立了高效的CRISPR-Cas9基因编辑平台，为后续改造奠定基础。多组学分析揭示了代谢瓶颈——包括磷酸戊糖途径通量不足、赤藓糖醇降解途径活跃和菌丝细胞形态——指导了对菌株167的精准代谢网络重塑，使赤藓糖醇产量提高2.3倍。最终，工程菌株以小麦秸秆木质纤维素水解液为唯一碳源，在5 L生物反应器中通过补料分批发酵实现赤藓糖醇产量214.2 g/L、得率0.60 g/g、生产率2.23 g/L/h，为目前以木质纤维素水解液生产赤藓糖醇的最高报道水平。
编译者解读
该研究的方法论价值在于将"底盘筛选—工具开发—多组学诊断—靶点改造—廉价原料验证"串联为一条可迁移的范式。选择天然低产泡野生菌而非改造实验室菌株的起泡性，规避了表面活性剂调控的复杂性。CRISPR-Cas9/NHEJ系统绕开了野生型菌株同源重组效率低的障碍，但随机突变可能带来脱靶风险。多组学指导的靶点选择提升了改造效率，但从2.3倍提升到214.2 g/L的产量跨越中，发酵工艺优化的贡献不容忽视。木质纤维素水解液成分批次差异是该路线产业化的潜在变量。
参考来源
期刊：Food Bioscience, 2026
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109992
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109992