来源：Metabolic engineering of Escherichia coli for efficient production of O-succinyl-L-homoserine（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
O-琥珀酰-L-高丝氨酸（OSH）是合成琥珀酸、异丁醇、1,4-丁二醇等C4平台化学品及L-甲硫氨酸的关键前体。本研究利用大肠杆菌鞭毛系统的三级转录调控网络，构建了自诱导表达系统，动态平衡细胞生长与OSH合成。通过阻断降解途径、解除反馈抑制、改造葡萄糖摄取系统、增强前体与辅因子供给，并系统筛选鞭毛系统自调控启动子，最终在5 L发酵罐中实现138.1 g/L的OSH产量，为目前报道的最高水平。
研究背景
石化工业带来的环境问题日益严峻，以可再生资源为原料的生物制造受到广泛关注。OSH可作为平台化合物，经化学转化生成琥珀酸、异丁醇和1,4-丁二醇等C4大宗化学品，这些产品广泛用于塑料、纤维和制药行业。在大多数生物体系中，O-乙酰-L-高丝氨酸（OAH）是合成含硫化合物（如L-甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸）的关键前体，但在大肠杆菌及其近缘肠杆菌中，OSH承担了这一角色。OSH还可通过甲硫醇的高效酶催化转化，作为工业L-甲硫氨酸生产的重要原料。L-甲硫氨酸是必需氨基酸，全球年市场规模超过160万吨，广泛应用于食品、饲料添加剂、制药和化妆品领域。大肠杆菌作为重要工业微生物，已被用于生产L-天冬氨酸家族氨基酸，包括L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-高丝氨酸，展现了OSH生产的潜力。
研究方法
2.1 菌株、质粒与试剂
本工作使用的所有细菌菌株和质粒及其相关特性列于表1和表S1中。大肠杆菌DH5α用于质粒构建，大肠杆菌MG1655用于构建OSH生产的工程菌株。KOD One PCR Master Mix（上海，TOYOBO）用于扩增供体DNA片段。DNA纯化试剂盒和质粒小提试剂盒购自Zymoclean（ZYMO RESEARCH，加利福尼亚），用于DNA制备。所有引物由擎科生物技术有限公司（上海，中国）合成，引物序列列于表S1中。胰蛋白胨和酵母提取物购自OXOID（英国）。氨基酸和抗生素购自Sigma-Aldrich（美国）。除非另有说明，所有其他化学品均购自麦克林（上海，中国）。
【数据】菌株：大肠杆菌DH5α（质粒构建）、大肠杆菌MG1655（工程菌株构建）；试剂来源：KOD One PCR Master Mix（TOYOBO）、Zymoclean DNA纯化试剂盒、擎科引物合成、OXOID胰蛋白胨和酵母提取物、Sigma-Aldrich氨基酸和抗生素、麦克林其他化学品
2.2 CRISPR-Cas9系统基因组编辑
基因如glk、galp和asd的天然启动子均被Ptrc启动子替换。基因如lacI、thrB和crr的敲除按先前描述的方法进行，基于靶基因序列设计含500 bp同源臂的供体DNA。通过引物设计将Ptrc启动子插入两个同源臂之间，然后通过重叠延伸PCR将含Ptrc启动子的供体DNA融合在一起。定点突变使用含pCas质粒的供体ssDNA进行。用于制备供体DNA片段的引物和靶向基因的sgRNA列于表S1中。将供体DNA（dsDNA）和相应的pTarget混合物转化到含pCas质粒的电感受态细胞中，该质粒表达由L-阿拉伯糖诱导的λ-Red重组系统以促进同源重组。阳性菌落首先通过使用靶基因上下游设计的引物进行菌落PCR初步鉴定。然后将阳性结果的菌落在LB培养基中培养，并用6-脱氧-L-甘露糖（Rha，0.5 mM）诱导表达sgRNA，利用Cas9消化相应的pTarget。通过单菌落传代消除pCas，菌落基因组作为模板通过PCR扩增基因片段。结果在NCBI中进行BLAST比对，以验证靶基因的成功敲除。
【数据】同源臂长度：500 bp；诱导剂：L-阿拉伯糖（λ-Red重组系统诱导）、6-脱氧-L-甘露糖（Rha，0.5 mM，sgRNA诱导）；验证方法：菌落PCR、NCBI BLAST比对；敲除基因：lacI、thrB、crr；启动子替换基因：glk、galp、asd
2.3 摇瓶发酵
将保存于−80 °C的工程菌株在37 °C琼脂平板上过夜培养进行活化。挑取单菌落接种到含5 mL LB培养基（每升：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g）的试管中，37 °C培养12 h获得种子培养液。将种子培养液（10%接种量）转移到含40 mL液体培养基（每升：葡萄糖35 g，酵母提取物3 g，蛋白胨4 g，KH₂PO₄ 2 g，MgSO₄·7H₂O 1.5 g，微量元素溶液5 mL）的500 mL摇瓶中，37 °C、220 rpm振荡培养48 h。必要时向培养基中添加氨苄青霉素（100 mg/L）、L-苏氨酸（0.2 g/L）和L-甲硫氨酸（0.2 g/L）。
【数据】种子培养：LB培养基5 mL，37°C，12 h；发酵培养基：葡萄糖35 g/L，酵母提取物3 g/L，蛋白胨4 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L，微量元素溶液5 mL/L；接种量：10%；温度：37°C；转速：220 rpm；时间：48 h；添加物：氨苄青霉素100 mg/L、L-苏氨酸0.2 g/L、L-甲硫氨酸0.2 g/L
2.4 5 L生物反应器补料分批发酵
挑取单菌落接种到含5 mL LB培养基的试管中，37 °C培养12 h作为一级种子培养液。将1%的培养液转移到两个含上述摇瓶培养基的500 mL摇瓶中培养10 h作为二级种子培养液。将所得种子培养液接种到含2.5 L液体培养基（每升：葡萄糖15 g，酵母提取物3.5 g，蛋白胨4 g，KH₂PO₄ 2 g，MgSO₄·7H₂O 1.5 g，L-甲硫氨酸0.2 g，微量元素溶液5 mL）的5 L发酵罐中，37 °C进行OSH生产。通过自动添加25% NH₃·H₂O（v/v）将pH维持在7，溶解氧设定为30%并与搅拌关联。通过补加800 g/L葡萄糖溶液将葡萄糖浓度保持在10 g/L以下。微量元素溶液每升含：Na₂B₄O₇·10H₂O 0.23 g，MnSO₄·4H₂O 0.5 g，CaCl₂ 1.35 g，ZnSO₄·7H₂O 2.25 g，CoCl₂·6H₂O 2 g，CuSO₄·5H₂O 1 g，FeSO₄·7H₂O 10 g，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.106 g，35% HCl 10 mL。
【数据】一级种子：LB培养基5 mL，37°C，12 h；二级种子：1%接种量，500 mL摇瓶，10 h；发酵罐：5 L，装液量2.5 L；发酵培养基：葡萄糖15 g/L，酵母提取物3.5 g/L，蛋白胨4 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L，L-甲硫氨酸0.2 g/L，微量元素溶液5 mL/L；温度：37°C；pH：7（25% NH₃·H₂O自动调节）；溶解氧：30%；补料：800 g/L葡萄糖溶液，维持葡萄糖<10 g/L
2.5 分析方法
通过测量600 nm吸光度监测细胞生长，使用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定残余葡萄糖浓度。样品以12,000 g离心10 min。适当稀释的上清液（10–20倍稀释）用于产物和副产物分析。O-琥珀酰-L-高丝氨酸和其他氨基酸通过柱前衍生化邻苯二甲醛（OPA）方法，使用高效液相色谱（HPLC，Agilent，美国）定量。氨基酸衍生物使用反相C18柱（Agilent，Phenomenex Luna C18 SB-aq）在30°C柱温下通过梯度洗脱分离，随后用紫外检测器在338 nm处检测。等度洗脱使用由乙腈（ACN）和10 mM磷酸钾缓冲液（pH 8，19:81，v/v）组成的流动相。流速设定为0.8 mL/min，进样量为10 μL。流动相使用前通过0.22 μm膜过滤并脱气。摇瓶发酵实验用重组荧光菌株进行。每2 h收集样品，每个样品取100 μL以8000 r/min离心10 min沉淀细胞。细胞沉淀用PBS洗涤三次，然后重悬于PBS中。取一部分重悬液稀释20倍，将200 μL稀释悬浮液转移到96孔板中。使用酶标仪测量OD600和荧光，激发和发射波长分别设定为485 nm和528 nm。
【数据】细胞生长监测：OD600；葡萄糖测定：DNS法；离心条件：12,000 g，10 min；上清稀释倍数：10–20倍；HPLC柱：Phenomenex Luna C18 SB-aq，柱温30°C；检测波长：338 nm；流动相：乙腈/10 mM磷酸钾缓冲液（pH 8，19:81，v/v）；流速：0.8 mL/min；进样量：10 μL；荧光检测：激发485 nm，发射528 nm；荧光样品：每2 h取样，8000 r/min离心10 min，PBS洗涤3次，稀释20倍，96孔板200 μL
2.6 统计分析
数据以三次独立培养的平均值和标准差表示。使用单因素方差分析（One-way ANOVA） followed by Dunnett多重比较检验确定显著性差异。统计显著性定义为：0.01 < p < 0.05（），p < 0.01（），p < 0.001（），p < 0.0001（****）。
【数据】统计方法：One-way ANOVA + Dunnett多重比较检验；样本量：三次独立培养；显著性标准：p<0.05，p<0.01，p<0.001，****p<0.0001
研究结果
3.1 构建由自调控启动子驱动thrABC表达的初始OSH生产菌株
通常，破坏降解途径、消除竞争途径和增强代谢通量是生产目标氨基酸的有效策略。为构建OSH生产的基础菌株，阻断了下游降解基因metB（编码O-琥珀酰高丝氨酸裂解酶）。metB和metL（编码天冬氨酸激酶II）基因共享同一操纵子。使用CRISPR-Cas9技术在metL起始密码子前插入来自pTrc99a的Ptrc启动子和RBS序列，并敲除metB末端26 bp，实现metB的一步缺失和metL表达的增强。在此，主要采用强Ptrc启动子替换天然启动子的策略来增强基因组中的基因表达，这需要在大肠杆菌对数生长期添加IPTG诱导剂。添加诱导剂会使工业操作复杂化，增加生产成本，并可能造成环境污染。根据乳糖操纵子原理，敲除编码大肠杆菌阻遏蛋白的lacI基因可解除Ptrc对诱导剂的依赖并增强其活性，得到菌株MG1655ΔlacIΔmetB（LLM00）。为将代谢通量导向OSH，我们尝试减弱thrB（编码高丝氨酸激酶）的表达，这是O-琥珀酰-L-高丝氨酸竞争途径中的关键基因。然而，直接敲除thrB会大幅阻断L-苏氨酸生产，抑制细胞生长，并需要外源L-苏氨酸补充以恢复，这增加了OSH生产成本和工艺复杂性。Zhang等人选择自调控启动子PfliC替换thrABC操纵子的天然启动子，该启动子在滞后期和指数早期表现出高转录强度，在指数后期和稳定期表现出低转录强度。这动态调节了thrB和thrC的表达，平衡了细胞生长和生产，同时消除了对外源苏氨酸的需求。因此，在LLM00菌株中同时进行了thrB基因敲除和用PfliC替换天然启动子，以研究对OSH生产的影响，分别生成菌株LLM01和LLM02。此外，考虑到thrA转录水平下调和内源metA表达量低，通过质粒过表达这两个基因以增强从L-天冬氨酸到OSH的代谢通量。值得注意的是，采用了thrA的反馈失调变体（thrA S345F）以解除L-苏氨酸的抑制。
LLM00菌株阻断了OSH降解基因metB并通过质粒增强thrA fbr和metA表达，积累了2.93 g/L OSH。直接敲除thrB使菌株LLM01的生物量比对照菌株LLM00降低38.1%，OSH滴度降至1.65 g/L（下降43.8%）。这表明完全阻断L-苏氨酸途径严重损害了细胞生长并阻碍了目标产物OSH的积累。在LLM02中用自调控启动子PfliC替换天然thrB启动子，生物量与LLM00无显著差异，而OSH浓度增加了25.5%至3.68 g/L，如图2b所示。因此，使用自调控启动子PfliC动态调控OSH竞争途径改善了OSH生产，且无需外源L-苏氨酸补充。由于LLM02中L-甲硫氨酸生物合成途径被完全阻断，需要在培养基中补充0.2 g/L L-甲硫氨酸以恢复细胞生长。尽管在大肠杆菌中实现了OSH合成，但产量仍然太低，需要进一步的代谢工程策略来增强OSH生物合成。生物合成途径中关键酶的低活性和反馈抑制被认为是避免氨基酸过度积累的基本调控机制。MetA的结构已存入蛋白质数据库（PDB ID：7CBE）。作为OSH生物合成的关键酶，L-高丝氨酸O-琥珀酰转移酶（MetA，由metA编码）遵循乒乓动力学机制：琥珀酰-CoA进入活性位点，亲核Cys攻击琥珀酰-CoA的硫酯键形成琥珀酰-Cys中间体。随后，高丝氨酸的羟基攻击琥珀酰基的羰基碳生成OSH。MetA受L-甲硫氨酸和SAM的负调控，对各种胁迫条件（如热、氧化或酸性胁迫）极其敏感。为优化MetA性能，将已报道的MetA热稳定突变和反馈抗性突变（Y294C、C79T、I229Y单突变体，L63F/I229Y、Q64E/Y294C双突变体，以及R27C/I296S/P298L三点突变体）通过定点突变进行组合。使用pkk-thrA fbr质粒构建了七个突变体，然后在LLM02菌株中过表达。摇瓶发酵显示，MetA Y294C突变体比野生型OSH滴度提高2.08倍，达到7.65 g/L（图2c）。为简洁起见，MetA Y294C以下简称为metA fbr。有趣的是，Y294C位于MetA蛋白表面（图2a）。推测位于MetA表面的突变可能影响酶的热稳定性。由于LLM02中L-甲硫氨酸途径已被阻断且生长需要外源L-甲硫氨酸，推测该突变体可解除L-甲硫氨酸反馈抑制并增强酶催化活性，值得进一步研究。
【数据】基础菌株LLM00：OSH产量2.93 g/L；LLM01（thrB敲除）：生物量降低38.1%，OSH 1.65 g/L（下降43.8%）；LLM02（PfliC替换）：OSH 3.68 g/L（提高25.5%），生物量与LLM00无显著差异；L-甲硫氨酸补充：0.2 g/L；MetA突变体：Y294C、C79T、I229Y、L63F/I229Y、Q64E/Y294C、R27C/I296S/P298L；MetA Y294C：OSH 7.65 g/L（提高2.08倍）；PDB ID：7CBE
3.2 改造乙醛酸循环和PTS系统对OSH生产的影响
在大肠杆菌OSH生产过程中，细胞生长所需的能量和还原力通过氧化途径获得，同时伴随副产物产生，如乙酸、乳酸、2,3-丁二醇和乙醇。乙酸和乳酸的合成不仅造成碳资源浪费，还使培养环境酸化。乙酸合成与ATP产生偶联，因此直接阻断乙酸合成途径通常会抑制细胞生长，不利于OSH合成。先前报道表明，降低iclR基因表达可能增加从乙酰-CoA节点到下游途径（如草酰乙酸）的碳通量，激活TCA循环中的乙醛酸循环，减少乙酸形成，缓解乙酸溢流问题。为进一步将碳通量导向OSH，敲除转录调节因子iclR生成菌株LLM03。摇瓶发酵显示LLM03积累了11.98 g/L的OSH，比菌株LLM02高1.57倍（图3b）。这表明iclR敲除激活了乙醛酸循环，削弱了无效TCA循环，将碳通量从乙酰-CoA节点导向下游TCA和乙醛酸循环，增加了苹果酸作为草酰乙酸前体的可用性，从而增强了OSH合成所需的能量和中间代谢物产生。葡萄糖是大肠杆菌最常用的发酵底物，通常利用磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）-磷酸转移酶系统（PTS）摄取葡萄糖。PTS系统负责特异性识别和介导单糖、二糖和糖醇的跨膜运输。然而，当大肠杆菌在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中生长时，PTS消耗约50%的胞内可用磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），而PEP是L-天冬氨酸家族氨基酸的直接前体。在芳香族化合物生产中保留磷酸烯醇式丙酮酸的策略包括删除...
【数据】菌株LLM03（iclR敲除）：OSH 11.98 g/L，比LLM02高1.57倍；PTS消耗约50%胞内PEP；副产物：乙酸、乳酸、2,3-丁二醇、乙醇
3.3 关键代谢节点工程化对OSH生产和细胞生长的影响
（注：原文节选在此处中断，以下内容基于摘要和结论中提及的策略进行框架性呈现，具体数据原文未详述。）
在PEP-PYR-OAA节点进行工程化改造，增强天冬氨酸到OSH途径的关键基因，并改造TCA循环以增强琥珀酰-CoA供给。摇瓶发酵研究了相关基因修饰对OSH生产和细胞生长的影响。
【数据】原文未详述具体数值
3.4 增强NADPH和ATP供给对摇瓶发酵中OSH生产和细胞生长的影响
研究了增强NADPH供给对OSH发酵的影响，以及增强ATP供给对OSH发酵的影响。通过摇瓶发酵研究了相关基因修饰的效果。
【数据】原文未详述具体数值
3.5 鞭毛系统自调控启动子的优化
鞭毛系统具有三层调控机制。通过摇瓶发酵研究了相关基因修饰对OSH生产和细胞生长的影响，并测定了绿色荧光蛋白的荧光强度。
【数据】原文未详述具体数值
3.6 不同构建菌株的补料分批发酵曲线
对不同构建菌株进行了补料分批发酵，获得了LLM22和LLM22-a的发酵曲线。
【数据】LLM22-a：5 L发酵罐OSH产量138.1 g/L，得率0.54 g/g，生产率1.44 g/L/h
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究通过阻断降解途径、增强乙醛酸循环、改造PTS系统、增加前体、辅因子和能量供给，并优化鞭毛系统自调控启动子以动态调控竞争途径，构建了高效的大肠杆菌OSH生产底盘。该整合策略实现了细胞生长与产物合成之间的动态平衡。工程菌株LLM22-a在摇瓶发酵中积累22.52 g/L OSH，在5 L生物反应器发酵中达到138.1 g/L，为目前报道的最高滴度。鞭毛系统自调控启动子在调控竞争途径关键基因时表现出细胞密度依赖性活性——指数生长期保持高活性，使thrABC正常表达为细胞生长提供充足L-苏氨酸；生长后期启动子活性下降，减少L-苏氨酸合成，将代谢通量重新导向OSH生物合成，从而提高OSH滴度。核心优势在于无需外源诱导剂即可实现细胞生长与OSH生产的动态平衡，提高了生产效率并降低了生产成本。
编译者解读：该研究最值得借鉴之处在于将鞭毛系统的天然时序调控逻辑"嫁接"到代谢途径的竞争节点上，用细胞自身的生长状态作为免费诱导信号。相比IPTG诱导或组成型强启动子，这种自诱导策略在工业放大中可省去诱导剂成本与操作步骤，同时避免过早分流前体导致的生长受损。不过，鞭毛启动子的活性受培养条件（温度、氧传递、营养）影响较大，放大到不同规模发酵罐时调控窗口是否漂移，是产业化前必须验证的问题。此外，138.1 g/L的滴度已接近氨基酸发酵工业水平，但得率0.54 g/g仍有提升空间——碳流向副产物（乙酸、乳酸、2,3-丁二醇、乙醇）的分流是否被完全压制，文中未给出副产物定量数据，这限制了对其碳代谢效率的完整评估。
参考来源
期刊：Biochemical Engineering Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110219
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110219