来源：From gibson assembly to cell-free expression: A guide to recombinant plasmid and toscana virus N protein production（Journal of Virological Methods）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
托斯卡纳病毒（TOSV）是地中海地区流行的蚊媒白蛉病毒，可引起脑膜炎和脑炎等中枢神经系统感染。N蛋白因其在感染细胞中大量积累且是主要免疫靶标，成为诊断开发的理想候选。本研究建立了一套从病毒扩增到重组抗原验证的完整工作流程：采用Gibson® Assembly技术将TOSV N基因克隆入pT7CFE1-CHis质粒，通过无细胞体外合成系统在16小时内完成蛋白表达，产量足以支撑Western blot等下游检测。该方案为快速抗原原型开发和初步表征提供了可推广的方法框架。
研究背景
托斯卡纳病毒（Phlebovirus toscanaense）属于布尼亚病毒目（Bunyavirales）白蛉病毒科（Phenuiviridae）白蛉病毒属。该属病毒为有包膜的球形病毒，基因组由负义单链RNA组成，分为大（L）、中（M）、小（S）三个片段，分别编码RNA依赖性RNA聚合酶、包膜糖蛋白和核蛋白（N）。白蛉病毒属包含10个种、100多种抗原性不同的病毒，按传播媒介分为白蛉传播和蜱传播两组。白蛉热病毒（SFV）包括三种血清型：西西里型（SFVS）、那不勒斯型（SFVN）和托斯卡纳型（TOSV）。SFVS和SFVN感染通常引起自限性疾病，表现为发热、肌痛和头痛，或呈无症状经过；而TOSV感染具有特殊临床意义——已知可导致中枢神经系统（CNS）感染，引发脑膜炎和脑膜脑炎。然而，地方性流行人群中的高血清阳性率与疾病的相对低发生率之间的矛盾表明，大多数感染为无症状或亚临床：流行区血清阳性率约为6%–25%，因地理位置、年龄和暴露情况而异。
N蛋白在感染细胞中大量积累，是急性TOSV感染期间的主要免疫原，因此被确定为有前景的诊断靶标。本研究旨在建立一套快速、易于适配的重组TOSV N蛋白生产流程，采用基于Gibson® Assembly的克隆策略，选用pT7CFE1-CHis质粒——该质粒专为无细胞蛋白表达系统的兼容性而选择。目前，从病毒扩增到重组抗原验证的完整端到端方案报道甚少，现有信息分散于不同条件下的独立研究中，研究人员需从多来源拼凑数据，对首次尝试重组病毒蛋白生产的实验室尤为困难。
研究方法
2.1 细胞培养维护
Vero E6（ATCC CRL 1585）细胞购自美国典型培养物保藏中心，在标准细胞培养条件（37°C，5% CO₂）下，于MEM（Euroclone）中维持培养，培养基补充10%热灭活胎牛血清（Fetal Bovine Serum South America origin EU Approved- Highly Tested, EuroClone）、1%谷氨酰胺（Glutammine 100X 200 mM, EuroClone）和1%青霉素/链霉素（Penicillin-Streptomycin solution 100X EuroClone）。细胞每周传代1–2次，稀释比例为1:3或1:4。
【数据】细胞系：Vero E6（ATCC CRL 1585）；温度：37°C；CO₂浓度：5%；血清浓度：10% FBS；谷氨酰胺：1%；青霉素/链霉素：1%；传代频率：每周1–2次；稀释比例：1:3或1:4
2.2 病毒扩增与感染动力学监测
用于病毒扩增的TOSV株RN_050724（第5代）最初从一名确诊阳性患者的脑脊液中分离（Brandolini et al., 2025）。其基因组已提交并被归类为A谱系。病毒接种物根据其滴度（1 × 10⁷ TCID₅₀）制备，目标0.5感染复数（MOI）使用以下公式计算：TCID × 0.7 / 待感染细胞数 = MOI。Vero E6细胞接种于T25培养瓶中，待达到90%汇合度（约2.5 × 10⁶细胞）时，移除培养基。细胞用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，病毒接种物在DMEM（含2% FBS）中稀释至终体积1 mL（Desmyter et al., 1968）。病毒吸附在37°C下进行3小时，之后加入7 mL含2% FBS的DMEM。每日通过20倍放大光镜评估细胞病变效应（CPE）监测感染，每24小时取上清液等分试样进行实时PCR（RT-PCR）以评估感染动力学。使用AgPath-ID™ One-Step RT-PCR Reagents（Applied Biosystems™）进行PCR。扩增在20 μL反应体系中进行，详见表1。RT-PCR所用引物和探针（表2）为Thirion等人2021年开发的序列，按建议浓度使用。所选PCR扩增条件此前由Brandolini等人2025年描述。细胞培养上清液在感染后72–96小时收获，对应RT-PCR Ct值为9–12。
【数据】病毒株：TOSV RN_050724（第5代，A谱系）；病毒滴度：1 × 10⁷ TCID₅₀；MOI：0.5；细胞汇合度：90%（约2.5 × 10⁶细胞）；PBS洗涤体积：5 mL；病毒接种终体积：1 mL（DMEM + 2% FBS）；吸附温度/时间：37°C，3小时；培养液添加体积：7 mL（DMEM + 2% FBS）；镜检放大倍数：20X；上清取样间隔：每24小时；RT-PCR反应体积：20 μL；收获时间：感染后72–96小时；Ct值：9–12
2.3 病毒RNA提取
感染培养液经300×g离心5分钟澄清，取200 μL使用RNeasy Mini Kit（QIAGEN, Hilden, Germany）按制造商方案提取病毒RNA。
【数据】离心条件：300×g，5分钟；样本体积：200 μL；试剂盒：RNeasy Mini Kit（QIAGEN）
2.4 逆转录为cDNA
使用SuperScript™ III Reverse Transcriptase（Invitrogen™）进行逆转录，每反应使用7 μL RNA生成cDNA，按制造商方案操作。
【数据】逆转录酶：SuperScript™ III；RNA用量：7 μL/反应
2.5 Gibson® Assembly正向和反向引物设计
设计正向和反向引物以扩增插入片段和骨架，在插入片段（TOSV N基因）和骨架（pT7CFE1-CHis质粒，Thermo Scientific™）之间产生末端重叠区域（通常20–40 bp），从而通过Gibson® Assembly方法实现无缝组装。N基因扩增的引物设计基于已提交的TOSV A谱系参考序列（KM275773.1），这是目前在意大利流行的唯一谱系（Ayhan & Charrel, 2020）。使用免费在线工具Benchling（Biology Software Benchling. San Francisco CA, 2025）进行设计。所得引物组见表3。
【数据】重叠区域长度：20–40 bp；参考序列：KM275773.1；设计工具：Benchling
2.6 核蛋白基因与pT7CFE1-Chis骨架的终点PCR
以TOSV cDNA为模板扩增N基因。所选PCR扩增条件为：94°C 2分钟，（95°C 30秒，56°C 30秒，72°C 45秒）× 35个循环，最终延伸72°C 7分钟，使用给定引物组。扩增在25 μL反应体系中使用FastStart High Fidelity（Roche）进行，含6% DMSO（终浓度）。以pT7CFE1-Chis（10 ng）（Thermo Scientific™）载体为模板获得线性骨架。所选PCR扩增条件为：94°C 2分钟，（94°C 30秒，60°C 30秒，68°C 5分钟）× 10个循环，（94°C 30秒，60°C 30秒，68°C 5分钟20秒）× 25个循环，最终延伸72°C 7分钟，每组引物均如此。扩增在25 μL反应体系中使用FastStart High Fidelity（Roche）进行，含6% DMSO（终浓度）。
【数据】N基因PCR条件：94°C 2 min；（95°C 30s，56°C 30s，72°C 45s）× 35循环；72°C 7 min；反应体积：25 μL；酶：FastStart High Fidelity（Roche）；DMSO终浓度：6%；骨架模板量：10 ng；骨架PCR条件：94°C 2 min；（94°C 30s，60°C 30s，68°C 5min）× 10循环；（94°C 30s，60°C 30s，68°C 5min20s）× 25循环；72°C 7 min
2.7 DNA凝胶纯化
在进入克隆步骤之前，使用Monarch® Spin DNA Gel Extraction Kit（NewEngland Biolabs）对DNA进行凝胶纯化。为纯化目标扩增子，浇铸厚度减薄、琼脂糖浓度较低（0.5–1%）的凝胶，以提高纯化DNA的最终产量。电泳后纵向切割凝胶，如图2所示。仅分子量标记泳道和第一个PCR产物泳道进行跑胶后染色（在1X TBE中与SYBR® Safe孵育15分钟，按Thermo Scientific™方案），并在UV光下暴露以切除目标条带。然后将染色和未染色的凝胶部分重新对齐，以染色部分为引导从剩余琼脂糖凝胶中切除相应区域。将多个凝胶切片放入微量离心管中，按制造商方案纯化。
【数据】琼脂糖浓度：0.5–1%；染色时间：15分钟；染色液：1X TBE + SYBR® Safe；试剂盒：Monarch® Spin DNA Gel Extraction Kit（NEB）
2.8 Gibson®组装
将均从琼脂糖凝胶中纯化的N基因和线性化骨架进行定量，以计算克隆反应中应包含的底物体积。使用NEBioCalculator工具（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）计算合适的试剂体积（μL）。骨架设定为50 ng，根据插入片段大小和所需摩尔比，该工具提供反应中插入片段的量，以获得3:1的DNA与质粒比率。10 μL克隆反应在50°C下孵育15分钟（In-Fusion® HD Cloning Kit User Manual, Takara Bio）。
【数据】骨架用量：50 ng；插入片段与质粒摩尔比：3:1；反应体积：10 μL；孵育温度：50°C；孵育时间：15分钟
2.9 细菌转化
转化时，将50 μL感受态大肠杆菌DH5α细胞（Thermo Scientific™）用Gibson®克隆反应液（10 μL）转化。同时进行对照Gibson®反应（省略骨架）的细菌转化。细胞在冰上孵育30分钟，然后在42°C热激45秒。向细胞中加入S.O.C培养基（350 μL）（Invitrogen™），然后在37°C、250 rpm振荡下孵育1小时。将转化细胞（200 μL）涂布到选择性Luria Broth（Invitrogen™）琼脂平板上，补充100 μg/mL氨苄青霉素（Gibco™），因为表达载体携带氨苄青霉素抗性基因，可筛选成功转化的细胞。平板在37°C过夜孵育，随后将单菌落划线到补充氨苄青霉素（100 μg/mL）的新鲜LB琼脂平板上，以避免平板上残留游离DNA导致的假阳性PCR结果。
【数据】感受态细胞体积：50 μL；菌株：E. coli DH5α；克隆反应体积：10 μL；冰上孵育：30分钟；热激：42°C，45秒；S.O.C培养基体积：350 μL；恢复培养：37°C，1小时，250 rpm；涂布体积：200 μL；抗生素：氨苄青霉素100 μg/mL；过夜孵育温度：37°C
2.10 菌落PCR
使用Taq DNA Polymerase（QIAGEN, Hilden, Germany）进行终点菌落PCR，按制造商说明操作。所选PCR扩增条件为：95°C 15分钟，（94°C 1分钟，62°C 1分钟，72°C 1分钟）× 30个循环，最终延伸72°C 10分钟。引物设计用于扩增重组载体：正向引物退火至插入位点上游的载体编码区域，反向引物靶向N基因的3′端。正向引物序列为[5′-ACCCCAT TGTATGGGATCTGATC-3′]，与表3中列出的Gene N反向引物配对，终浓度为200 μM。扩增在25 μL反应体系中进行，菌落直接重悬其中。
【数据】PCR条件：95°C 15 min；（94°C 1min，62°C 1min，72°C 1min）× 30循环；72°C 10 min；正向引物序列：5′-ACCCCAT TGTATGGGATCTGATC-3′；引物终浓度：200 μM；反应体积：25 μL
2.11 小量制备质粒提取的起始培养
质粒扩增和提取按GeneJET™ Plasmid Miniprep方案（Thermo Scientific™）进行。将一个单阳性菌落接种到5 mL补充氨苄青霉素（100 µg/mL）的LB肉汤中，在37°C、250 rpm振荡下过夜孵育。提取完成后，质粒……
【数据】LB体积：5 mL；氨苄青霉素浓度：100 µg/mL；孵育温度：37°C；振荡速度：250 rpm；孵育时间：过夜
研究结果
3.1 Gibson组装及上游准备
通过两个底物的PCR扩增，成功实施了pT7CFE1-CHis载体与TOSV N基因序列重组的合成方案。PCR仅需少量优化；然而，扩增后对质粒和基因均进行凝胶纯化是必要的。实施了最大化质粒和目标基因回收产量的策略——在单柱上处理多个条带并使用极薄的浇铸琼脂糖凝胶（如材料与方法中所述）。这使我们获得了较高浓度的质粒（>35 ng/μL）和N基因（>20 ng/μL）。
【数据】质粒浓度：>35 ng/μL；N基因浓度：>20 ng/μL；琼脂糖凝胶：极薄浇铸
3.2 转化大肠杆菌DH5α的筛选结果及质粒提取质量
细菌转化在选择性琼脂平板上产生58个菌落。对照Gibson®连接反应（省略骨架）通常不产生菌落或仅产生少数菌落（约2–3个）。挑取30个菌落（51.7%）进行菌落PCR，其中10个（33%）经菌落PCR筛选为阳性。将若干PCR阳性菌落过夜培养（约16小时），用GeneJET Plasmid MiniPrep Kit（Thermo Scientific™）提取质粒，获得了优异的DNA浓度以及A260/280和A260/230比值结果（表4）。随后将单个测序菌落使用GeneJET Plasmid MaxiPrep Kit（Thermo Scientific™）进行放大；产量和提取结果见表5。
【数据】转化菌落数：58个；对照菌落数：约2–3个；挑取菌落数：30个（51.7%）；阳性菌落数：10个（33%）；过夜培养时间：约16小时；质粒提取试剂盒：GeneJET Plasmid MiniPrep Kit
3.3 Oxford Nanopore测序结果
使用FastQC v0.12.1对FASTQ文件进行质量评估。共产生15,357条reads，对应65,148,751个测序碱基，平均读长4,242.3 bp。将测序结果与相应参考序列比较，确认关键调控元件中无突变或缺失。
【数据】reads数：15,357条；测序碱基数：65,148,751 bp；平均读长：4,242.3 bp；质控工具：FastQC v0.12.1
3.4 DNA清理、体外蛋白合成、纯化及Western Blot分析
DNA清理程序产生了优异结果，如表6所示。使用Thermo Scientific™ 1-Step Human High-Yield Mini IVT Kit进行蛋白生产后，HisPur™ Ni-NTA Spin Columns（Thermo Scientific™）实现了目标蛋白的纯化。SDS-PAGE分析和Western blot均取得满意结果，确认了重组N蛋白的存在和免疫原性。SDS-PAGE凝胶染色和Western Blot结果如图3A和3B所示。在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上显示可见蛋白条带的三个组分——对应洗脱组分3、4和5——经定量后蛋白浓度分别为60、111和150 µg/mL。基于上样体积（16.5 µL），对应的上样蛋白量分别为0.99、1.83和2.48 µg。取相同体积的洗脱组分5用于Western blot，对应每孔2.48 µg蛋白。
【数据】洗脱组分3蛋白浓度：60 µg/mL；洗脱组分4蛋白浓度：111 µg/mL；洗脱组分5蛋白浓度：150 µg/mL；上样体积：16.5 µL；洗脱组分3上样量：0.99 µg；洗脱组分4上样量：1.83 µg；洗脱组分5上样量：2.48 µg；Western blot上样量：2.48 µg/孔
讨论与解读
本研究的主要目标是开发一套高效、优化的方案，用于生产TOSV N蛋白以支持血清学诊断——N蛋白是急性TOSV感染期间的主要免疫原（Cusi & Savellini, 2011）。研究评估了使用pT7CFE1-Chis载体配合1-Step Human High-Yield Mini IVT Kit（Thermo Scientific™）的蛋白生产——这是一个针对该载体优化的无细胞系统。目标基因通过Gibson® Assembly被高效克隆入pT7CFE1-CHis载体。鉴于经典限制性内切酶克隆替代方案的日益增多以及当前可用的广泛表达系统，有必要对这些分子克隆和蛋白合成选项进行审视（Celie et al., 2016）。迄今为止，很少有完全集成的端到端方案在单一方法学框架内描述从病毒扩增到重组抗原验证的整个工作流程。由于现有信息分散于众多在不同条件下进行的独立研究中，研究人员必须从多来源拼凑数据，这使得完整流程的实施尤为困难——对首次尝试重组病毒蛋白生产的实验室而言尤其如此。扩展方法学知识并推动TOSV研究对于诊断工具开发、改善患者管理和流行病学监测具有重要意义。
编译者解读：该研究的方法学价值在于将Gibson组装与无细胞表达系统串联，省去了传统克隆中限制性酶切和连接步骤，将构建到蛋白验证的周期压缩至数天。pT7CFE1-CHis载体的选择具有前瞻性——其与无细胞系统的即插即用兼容性减少了宿主毒性蛋白表达的干扰。不过，该方案目前仅在单一TOSV株上验证，N蛋白产量（最高150 µg/mL）虽足以支撑Western blot，但能否满足ELISA板包被或侧向层析试纸条等诊断开发的大规模需求，尚需进一步放大实验验证。
参考来源
期刊：Journal of Virological Methods, 2027
DOI: 10.1016/j.jviromet.2026.115455
DOI: 10.1016/j.jviromet.2026.115455