来源：Integrated experimental and computational insights into co-production of pectinase and xylanase from Aspergillus niger: Optimization, purification and molecular characterization（Bioresource Technology Reports）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
果胶酶和木聚糖酶是饲料与农业废弃物生物转化中常用的糖苷水解酶。本研究利用一株天然黑曲霉EBL79，以麦麸和橙皮为底物同时生产果胶酶和木聚糖酶，通过响应面法优化发酵参数，经硫酸铵沉淀、透析、离子交换和凝胶过滤逐步纯化，使两种酶比活力分别提升7.93倍和6.71倍。研究进一步结合动力学分析、分子对接和100 ns分子动力学模拟，在实验与计算两个层面刻画了酶的结构与催化特征。该工作为低成本、可放大的双酶共产体系提供了完整的数据链条。
研究背景
家禽养殖高度依赖玉米、豆粕和小麦等植物性饲料，这些原料富含非淀粉多糖（NSP），主要是木聚糖和果胶。这类复杂多糖会升高肠道黏度、阻碍营养吸收、降低饲料利用率。单胃动物缺乏有效降解NSP的内源酶，因此需要外源补充糖苷水解酶以提高饲料消化率。木聚糖酶和果胶酶分别水解植物细胞壁中的半纤维素和果胶组分，促进养分释放并降低抗营养效应。两者联用具有协同作用——果胶降解后，木聚糖酶更易接触底物。然而，这类酶在工业上通常分别发酵生产，成本居高不下。利用单一菌株同时高效共产两种酶，成为降低生产成本、提升可持续性的关键策略。
研究方法
2.1 微生物与菌种维护
本研究使用一株此前已分离并完成分子鉴定的天然黑曲霉（A. niger）真菌分离株。该菌株经双向测序，分别获得正向和反向序列，已提交至NCBI GenBank数据库，登录号分别为PV056011（正向）和PV056012（反向）。培养物保存于4 °C的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面上，定期传代以维持活力。取培养5天的PDA平板用于孢子收获，加入无菌0.1%（v/v）Tween-80溶液并轻轻刮取表面。为去除菌丝碎片，孢子悬液经无菌细棉布过滤。使用血细胞计数板将孢子浓度调整至约1 × 10⁷ 孢子/mL，所得悬液用作接种物。
【数据】菌株：黑曲霉EBL79；GenBank登录号：PV056011（正向）、PV056012（反向）；保存温度：4°C；Tween-80浓度：0.1%（v/v）；孢子浓度：约1 × 10⁷ 孢子/mL；PDA平板培养时间：5天
2.2 submerged fermentation共产酶
在50 mL锥形瓶中进行 submerged fermentation，装液量为50 mL基础生产培养基，其组成如下（g/L）：KH₂PO₄ 2.0；K₂HPO₄ 1.0；MgSO₄·7H₂O 0.5；CaCl₂ 0.1；FeSO₄·7H₂O 0.01。按上述说明向基础培养基中加入适当的碳源和氮源。锥形瓶于121 °C灭菌15 min，接种5%（v/v）孢子悬液。发酵在150 rpm振荡条件下进行。
【数据】培养基体积：50 mL；KH₂PO₄：2.0 g/L；K₂HPO₄：1.0 g/L；MgSO₄·7H₂O：0.5 g/L；CaCl₂：0.1 g/L；FeSO₄·7H₂O：0.01 g/L；灭菌温度：121°C；灭菌时间：15 min；接种量：5%（v/v）；转速：150 rpm
2.3 碳源和氮源筛选
测试了1%（w/v）的多种碳源对黑曲霉共产果胶酶和木聚糖酶的影响，包括：麦麸、橙皮粉、麦麸:橙皮混合物（1:1）、米糠、甘蔗渣和玉米芯粉。每组实验均在相同的基础发酵条件下进行，即蛋白胨（0.5% w/v）作为氮源、初始pH 5.5、温度30 °C、接种量5%、培养5天。测定酶活力，选择果胶酶和木聚糖酶产量最高的碳源用于后续研究。使用不同的有机和无机氮源（0.5% w/v）测试果胶酶和木聚糖酶的共产情况，包括：蛋白胨、酵母提取物、尿素、硫酸铵、硝酸钠和硝酸铵。选择能促进两种酶同时生产的氮源用于后续优化。
【数据】碳源浓度：1%（w/v）；碳源种类：麦麸、橙皮粉、麦麸:橙皮（1:1）、米糠、甘蔗渣、玉米芯粉；氮源浓度：0.5%（w/v）；氮源种类：蛋白胨、酵母提取物、尿素、硫酸铵、硝酸钠、硝酸铵；初始pH：5.5；温度：30°C；接种量：5%；培养时间：5天
2.4 酶活力测定
#### 2.4.1 果胶酶活力测定
以柑橘果胶为底物测定果胶酶活力。反应体系包含0.5 mL适当稀释的酶液和0.5 mL 1%（w/v）果胶（溶于0.05 M柠檬酸缓冲液，pH 5.0）。混合物于50 °C孵育10 min。随后加入1.0 mL二硝基水杨酸（DNS）试剂并煮沸，终止反应。冷却后在540 nm处测定吸光度。一个果胶酶活力单位（U）定义为在测定条件下每分钟释放1 μmol半乳糖醛酸的酶量。
【数据】底物：1%（w/v）柑橘果胶；缓冲液：0.05 M柠檬酸缓冲液，pH 5.0；酶液体积：0.5 mL；底物体积：0.5 mL；孵育温度：50°C；孵育时间：10 min；DNS试剂体积：1.0 mL；检测波长：540 nm；单位定义：每分钟释放1 μmol半乳糖醛酸
#### 2.4.2 木聚糖酶活力测定
木聚糖酶活力以1%（w/v）山毛榉木聚糖（溶于0.05 M磷酸缓冲液，pH 5.0）测定。将0.5 mL酶液与0.5 mL底物混合，反应混合物于50 °C孵育10 min，释放的还原糖用DNS法定量。一个木聚糖酶活力单位（U）定义为在测定条件下每分钟释放1 μmol木糖的酶量。
【数据】底物：1%（w/v）山毛榉木聚糖；缓冲液：0.05 M磷酸缓冲液，pH 5.0；酶液体积：0.5 mL；底物体积：0.5 mL；孵育温度：50°C；孵育时间：10 min；检测方法：DNS法；单位定义：每分钟释放1 μmol木糖
2.5 响应面法统计优化
采用响应面法（RSM）优化影响酶共产的四个重要工艺变量：pH（A）、温度（B）、培养时间（C）和接种量（D）。使用Design-Expert软件v13.0.14（美国）创建包含30个实验运行的中心复合设计（CCD）。为分析模型的显著性，进行方差分析（ANOVA），实验数据拟合为二次多项式。生成三维响应面图以研究变量间的交互效应。进行数值优化以确定果胶酶和木聚糖酶同时生产的有利条件。预测的最优条件随后进行实验验证。
【数据】软件：Design-Expert v13.0.14；设计方法：中心复合设计（CCD）；实验运行数：30；优化变量：pH、温度、培养时间、接种量；模型类型：二次多项式
2.6 酶纯化
发酵液于4 °C、10,000 ×g离心。上清液缓慢加入固体硫酸铵至80%饱和度，于4 °C持续搅拌。离心收集沉淀蛋白，溶于0.05 M磷酸缓冲液（pH 7.0）。在相同缓冲液中透析过夜，以去除酶液中过量盐分。随后进行离子交换层析进一步纯化酶。将两种酶的透析样品加载到预先用0.05 M磷酸缓冲液（pH 7.0）平衡的DEAE-纤维素离子交换柱上。使用–1.0 M NaCl线性梯度洗脱结合蛋白。收集馏分，测定果胶酶和木聚糖酶活力。合并活性馏分用于进一步纯化。使用Sephadex G-75凝胶过滤层析进行额外纯化。层析柱用0.05 M磷酸缓冲液（pH 7.0）平衡，加入合并的馏分。监测洗脱馏分的酶活力和蛋白含量，合并活性馏分。使用SDS-PAGE（12%聚丙烯酰胺凝胶）分析酶的纯度和分子量。用考马斯亮蓝染色显示蛋白条带，并在SDS-PAGE分析中与标准分子量标记（Protein Ladder，10–180 kDa，Thermo Fisher Scientific，美国）进行比较。
【数据】离心条件：10,000 ×g，4°C；硫酸铵饱和度：80%；缓冲液：0.05 M磷酸缓冲液，pH 7.0；透析时间：过夜；离子交换柱：DEAE-纤维素；NaCl梯度：–1.0 M；凝胶过滤：Sephadex G-75；SDS-PAGE浓度：12%；分子量标记范围：10–180 kDa
2.7 动力学和热力学参数测定
通过在一系列底物浓度范围内测定酶活力，确定纯化果胶酶和木聚糖酶的动力学参数（Km和Vmax）。Km和Vmax基于Michaelis-Menten关系使用Lineweaver-Burk图估算。在Lineweaver-Burk图中，Km和Vmax分别由x轴截距（−1/Km）和y轴截距（1/Vmax）确定。同时分析热力学参数，如活化能（Ea）、焓（ΔH）和熵（ΔS），以确定酶的催化和结构稳定性。Ea由Arrhenius图（lnV vs. 1/T）计算，ΔH和ΔS分别由每种酶的Eyring图（ln(V/T) vs. 1/T）推导。
【数据】动力学参数：Km、Vmax；分析方法：Lineweaver-Burk图；热力学参数：Ea、ΔH、ΔS；Ea计算：Arrhenius图（lnV vs. 1/T）；ΔH和ΔS计算：Eyring图（ln(V/T) vs. 1/T）
2.8 分子建模与分子对接研究
使用SAVES v6.1中的PROCHECK进行Ramachandran图分析，评估主链二面角（φ和ψ）的分布，评价建模的果胶酶和木聚糖酶结构的立体化学质量。使用AutoDockTools v1.5.7进行配体和蛋白的制备以及配体与蛋白的对接。每种酶分别与四种候选配体对接。在每次对接模拟中，在活性位点区域周围设置网格盒以允许配体柔性。根据最低预测结合能选择最佳对接构象。使用PyMOL和Discovery Studio Visualizer研究蛋白-配体相互作用。分子对接后使用GROMACS进行分子动力学模拟，以识别…
【数据】软件：SAVES v6.1（PROCHECK）、AutoDockTools v1.5.7、PyMOL、Discovery Studio Visualizer、GROMACS；配体数量：4种；对接方法：网格盒设置于活性位点区域；构象选择标准：最低预测结合能
研究结果
3.1 碳源和氮源筛选
在测试的碳源中，麦麸:橙皮混合物（1:1）共产效果最高，果胶酶比活力为8.43 U/mg，木聚糖酶比活力为9.43 U/mg。单一底物（单独麦麸和单独橙皮）的酶活力较低。在氮源方面，蛋白胨支持最高的酶比活力（果胶酶：7.98 U/mg；木聚糖酶：9.02 U/mg），而无机氮源的比活力最低。
【数据】最佳碳源：麦麸:橙皮（1:1）；果胶酶比活力：8.43 U/mg；木聚糖酶比活力：9.43 U/mg；最佳氮源：蛋白胨；果胶酶比活力（蛋白胨）：7.98 U/mg；木聚糖酶比活力（蛋白胨）：9.02 U/mg；无机氮源：比活力最低
3.2 响应面法统计优化
本研究采用中心复合设计，旨在确定培养时间、pH、温度和接种量对酶共产的交互效应。补充表1显示了果胶酶和木聚糖酶活力的实验值。针对两个响应构建了二次多项式。
【数据】设计方法：中心复合设计；变量数：4（培养时间、pH、温度、接种量）；模型：二次多项式
#### 3.2.1 响应面二次模型方差分析
基于响应面过程制备的ANOVA表（补充表2和3）显示，pH、温度、培养时间和接种量是影响果胶酶和木聚糖酶产量的选定变量。果胶酶和木聚糖酶的模型F值分别为3.04和2.83，表明二次模型具有统计学显著性。获得观测F值的概率分别为果胶酶2.04%和木聚糖酶2.72%，表明二次模型具有统计学显著性（p = 0.0204和p = 0.0272）。当p值（Prob > F）低于0.05时，模型项被认为显著。在本实验中，两种酶的显著模型项为BC（温度×培养时间交互作用）、A²（pH二次效应）和D²（接种量二次效应）。其他因素的p值超过0.1000，意味着这些因素对酶产量的影响相对不显著。果胶酶（F值 = 1.40，p = 0.3739）和木聚糖酶（F值 = 1.60，p = 0.3159）的失拟均不显著，表明失拟不显著大于纯实验误差。非显著失拟表明所建模型充分代表了实验数据，因此可用于在实验范围内预测酶产量。回归分析显示，果胶酶的R²值为0.7391，木聚糖酶为0.7256，意味着响应面模型分别可解释73.91%和72.56%的变异性。果胶酶和木聚糖酶的调整R²值分别为0.4957和0.4695，而相应的预测R²值分别为−0.2056和−0.2979。负的预测R²值表明模型对新观测值的预测能力有限。因此，尽管模型对观察到的实验响应提供了合理的描述，但其预测性能应谨慎解释。模型因此被认为有助于解释所研究变量的效应并识别实验设计空间内的有利条件，而非作为超出所研究条件的广泛预测模型。调整R²和预测R²值存在差异，因此模型预测能力中等，可能存在实验数据的潜在变异性。果胶酶和木聚糖酶的Adeq Precision值分别为6.528和6.291，超过推荐值4，表明信噪比充足。然而，这一结果应与负的预测R²值一起解释，后者表明模型的预测能力有限。回归系数表明，pH和温度对酶产量显示负的线性影响，培养时间显示弱的正影响（补充表4和5）。温度与培养时间之间的交互项（BC）具有正系数，意味着这些参数对酶产量具有协同效应。此外，pH（A²）和接种量（D²）的正二次系数表明这两个因素在最佳水平下对酶的生产起显著作用。生成三维响应面和相应的等高线图以可视化所研究工艺变量对果胶酶和木聚糖酶产量的效应和交互作用（图1和图2）。
【数据】果胶酶模型F值：3.04；木聚糖酶模型F值：2.83；果胶酶p值：0.0204；木聚糖酶p值：0.0272；显著模型项：BC、A²、D²；果胶酶失拟：F = 1.40，p = 0.3739；木聚糖酶失拟：F = 1.60，p = 0.3159；果胶酶R²：0.7391；木聚糖酶R²：0.7256；果胶酶调整R²：0.4957；木聚糖酶调整R²：0.4695；果胶酶预测R²：−0.2056；木聚糖酶预测R²：−0.2979；果胶酶Adeq Precision：6.528；木聚糖酶Adeq Precision：6.291
3.3 酶纯化
果胶酶和木聚糖酶通过硫酸铵沉淀、透析、离子交换和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化。纯化过程中总酶活力随时间下降，而比活力显著增加，表明污染蛋白被逐步去除。粗果胶酶和木聚糖酶的比活力分别为8.43 U/mg和9.43 U/mg（表1）。硫酸铵沉淀后，果胶酶和木聚糖酶的比活力分别增至20.08 U/mg和19.75 U/mg。随后经透析、离子交换层析及Sephadex G-75凝胶过滤纯化，果胶酶和木聚糖酶的比活力分别达到66.87 U/mg和62.64 U/mg，纯化倍数分别为7.93倍和6.71倍。纯化后的酶经SDS-PAGE分析，显示出与目标酶对应的显著蛋白条带，表明纯度成功（图3）。果胶酶和木聚糖酶的分子量估计分别约为37 kDa和45 kDa，与先前报道的真菌果胶酶和木聚糖酶一致。
【数据】粗酶果胶酶比活力：8.43 U/mg；粗酶木聚糖酶比活力：9.43 U/mg；硫酸铵沉淀后果胶酶比活力：20.08 U/mg；硫酸铵沉淀后木聚糖酶比活力：19.75 U/mg；纯化后果胶酶比活力：66.87 U/mg；纯化后木聚糖酶比活力：62.64 U/mg；果胶酶纯化倍数：7.93倍；木聚糖酶纯化倍数：6.71倍；果胶酶分子量：约37 kDa；木聚糖酶分子量：约45 kDa
3.4 动力学研究与表征
通过在不同温度（20至100 °C）下孵育反应混合物，测试温度对果胶酶和木聚糖酶活力的影响，以确定酶活力的最适温度。木聚糖酶在29–30 °C显示最大活力，而果胶酶在约30 °C显示最大活力（图4G–H）。图4E和F的结果显示，果胶酶活力在pH 5至7保持相对稳定，而两种酶的最大活力均在pH 6观察到。根据Nawaz等（2021），pH 3–8范围使黑曲霉产量最高至最大活力。还测定了黑曲霉果胶酶的动力学参数。使用Lineweaver-Burk分析确定纯化果胶酶和木聚糖酶的动力学参数（图4A–B）。Lineweaver-Burk图显示果胶酶（R² = 0.9983）和木聚糖酶（R² = 0.9984）均具有强线性关系。Km和Vmax值分别由x轴截距（−1/Km）和y轴截距（1/Vmax）计算。果胶酶的Km为8.74 mg/mL，Vmax为121.95 U/mL，而木聚糖酶的Km为7.40 mg/mL，Vmax为111.11 U/mL。Michaelis-Menten图（图4C–D）显示底物浓度与反应速度之间呈双曲线关系，与随底物浓度增加而逐渐饱和一致。
【数据】温度范围：20–100°C；木聚糖酶最适温度：29–30°C；果胶酶最适温度：约30°C；最适pH（两种酶）：pH 6；果胶酶pH稳定范围：pH 5–7；果胶酶Lineweaver-Burk R²：0.9983；木聚糖酶Lineweaver-Burk R²：0.9984；果胶酶Km：8.74 mg/mL；果胶酶Vmax：121.95 U/mL；木聚糖酶Km：7.40 mg/mL；木聚糖酶Vmax：111.11 U/mL
3.5 热力学研究
热失活的热力学参数分别通过Arrhenius图（ln V vs. 1/T；图4I, J）和Eyring图（ln(V/T) vs. 1/T；图4K, L）对果胶酶和木聚糖酶进行测定。对于果胶酶，活化能（Ea）为48.62 kJ/mol，失活焓（ΔH）为−24.25 kJ/mol，失活熵（ΔS）为−304.5 J/mol·K，323 K时的失活吉布斯自由能（ΔG）为73.1 kJ/mol。对于木聚糖酶，相应值为Ea = 37.91 kJ/mol，ΔH = −63.96 kJ/mol，ΔS = −416.9 J/mol·K，ΔG（323 K）= 70.7 kJ/mol。Ea由Arrhenius图的斜率计算…
【数据】果胶酶Ea：48.62 kJ/mol；果胶酶ΔH：−24.25 kJ/mol；果胶酶ΔS：−304.5 J/mol·K；果胶酶ΔG（323 K）：73.1 kJ/mol；木聚糖酶Ea：37.91 kJ/mol；木聚糖酶ΔH：−63.96 kJ/mol；木聚糖酶ΔS：−416.9 J/mol·K；木聚糖酶ΔG（323 K）：70.7 kJ/mol
3.6 分子建模与对接分析
Ramachandran图分析用于评估建模的果胶酶和木聚糖酶结构的立体化学质量（图5）。大多数残基位于最 favored 区域，表明模型结构合理。
分子对接显示，果胶酶与双半乳糖醛酸（digalacturonic acid）的结合亲和力为−6.3 kcal/mol，木聚糖酶与山毛榉木聚糖（beechwood xylan）的结合亲和力为−8.7 kcal/mol（图6）。PyMOL和Discovery Studio用于可视化蛋白-配体相互作用，包括氢键分析和相互作用分析。
【数据】果胶酶-双半乳糖醛酸结合亲和力：−6.3 kcal/mol；木聚糖酶-山毛榉木聚糖结合亲和力：−8.7 kcal/mol
3.7 分子动力学模拟
在100 ns分子动力学模拟期间，计算了木聚糖酶-山毛榉木聚糖和果胶酶-双半乳糖醛酸复合物的均方根涨落（RMSF）和均方根偏差（RMSD），以确定蛋白-配体复合物的稳定性和酶的残基水平柔性（图7）。
GROMACS平衡曲线在蛋白-配体复合物的分子动力学模拟中获得（图8），包括：（a）系统平衡期间的密度变化，（b）蛋白和配体的λ（lambda）耦合参数曲线，（c）整个模拟过程中的温度演化，（d）温度平衡…
【数据】模拟时间：100 ns；分析指标：RMSF、RMSD；模拟软件：GROMACS；监测参数：密度、λ耦合参数、温度
讨论与解读
本研究展示了一个完整的果胶酶和木聚糖酶共产体系：从天然黑曲霉菌株出发，经培养基优化、统计建模、生化纯化到计算机验证。与传统的单酶生产研究相比，两种工业相关糖苷水解酶的同步优化具有科学新颖性和经济意义。碳源筛选表明，麦麸:橙皮混合物比单一底物产生更高的双酶产量，这可能与丝状真菌中多糖敏感转录系统对碳水化合物的诱导表达有关——黑曲霉的木聚糖降解基因被富含木聚糖的底物激活，而富含果胶的底物触发果胶降解途径。纯化过程中比活力大幅提升而总活力下降，说明污染蛋白被有效去除。动力学分析显示两种酶对各自底物均有较强的亲和力，热力学参数则揭示了它们在中温条件下的催化稳定性。分子对接和100 ns分子动力学模拟从原子层面支持了酶-配体复合物的结构稳定性。
编译者解读：该研究的亮点在于将发酵优化、经典蛋白纯化与计算模拟串联为一条完整证据链，为农业废弃物（麦麸、橙皮）的高值化利用提供了可行路径。双酶共产确实能降低生产成本，但研究也存在局限：预测R²为负值说明模型的泛化能力有限，纯化步骤较多可能制约规模化放大，分子动力学模拟尚未与定点突变实验联动。未来若能将计算预测与酶工程改造结合，有望进一步提升催化效率。
参考来源
期刊：Bioresource Technology Reports, 2026
DOI: 10.1016/j.biteb.2026.103023
DOI: 10.1016/j.biteb.2026.103023