来源：Isolation of potential cellulose-degrading fungi from soil and kinetic comparison of cellulase from Aspergillus niger with commercial enzyme and biodegradation of municipal plant waste（Next Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
纤维素是植物生物质的主要成分，其结晶结构和β-1,4-糖苷键使其难以水解。本研究从土壤中分离筛选纤维素分解真菌，发现黑曲霉（Aspergillus niger）水解能力最强（HC=4.58），其粗酶液在pH 5.0、70°C、60 min孵育条件下活性最佳。动力学分析显示，黑曲霉纤维素酶的Km（0.9432 g/L）低于商业酶（7.3510 g/L），Vmax（1.1078 mg mL⁻² min⁻¹）高于商业酶（0.7657 mg mL⁻² min⁻¹），表明其催化效率更优。Mn²⁺和Fe²⁺可增强酶活性，其中Mn²⁺预孵育1小时后仍保留75%以上活性。在黑曲霉、绿色木霉和哈茨木霉中，黑曲霉对混合叶片废弃物的降解效果最佳，平板和堆肥中最大失重率分别达52%和55%。
研究背景
纤维素是植物生物质的主要组分，因其结晶结构和β-1,4-糖苷键而难以水解。纤维素酶通常由真菌和细菌等微生物分泌，通过内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的协同作用将纤维素水解为葡萄糖。真菌纤维素酶的最适pH因物种而异，多数情况下最适pH范围为3.0至6.0。温度是调控微生物生长和合成的关键环境因素之一，但不同生物间存在差异。Vmax值的差异可归因于真菌种类、底物、加工工艺及其他环境因素的不同。已有报道显示，Mn²⁺和Fe²⁺可刺激灰绿曲霉的纤维素酶活性。植物废弃物是城市固体废弃物中主要的纤维素类废物之一，产生量巨大。在能产生多种酶、催化众多代谢过程的广泛真菌谱中，仅有少数真菌能够通过分泌大量胞外纤维素酶复合物来降解纤维素。真菌，尤其是曲霉和木霉等丝状真菌，因其分泌能力和对固体底物的适应性，被认为是高效的纤维素酶生产者。
研究方法
2.1 纤维素分解真菌的分离
土壤样品在含羧甲基纤维素（CMC）的肉汤中富集，于120 rpm下孵育4–5天。系列稀释液涂布于CMC琼脂培养基上，30°C孵育5天。纯化分离株保存在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面上。
【数据】培养基：CMC肉汤/CMC琼脂/PDA斜面；转速：120 rpm；富集时间：4–5天；孵育温度：30°C；孵育时间：5天
2.2 纤维素分解活性筛选
采用刚果红染色法在CMC琼脂平板上鉴定阳性分离株，依据透明圈形成判断。所有分离真菌物种均用0.1%刚果红染料溶液进行筛选，随后用1 M NaCl脱色。菌落周围出现水解透明圈表明该真菌物种合成了纤维素酶。水解能力（HC）按以下公式计算：
HC = 透明圈直径 / 菌落直径
【数据】染料浓度：0.1%刚果红；脱色剂：1 M NaCl；计算公式：HC=透明圈直径/菌落直径
2.3 纤维素酶生产
将黑曲霉（HC=4.58）接种于补充了碱预处理生物质的CMC基础盐培养基中。30°C培养8天后，收集上清液作为粗酶液。
【数据】菌株：黑曲霉（HC=4.58）；培养基：CMC基础盐培养基+碱预处理生物质；温度：30°C；时间：8天
2.4 酶活测定与优化
采用DNS法测定内切葡聚糖酶活性。对pH（3–8）、温度（30–80°C）、孵育时间（10–80 min）、底物浓度（2–20 g/L）等参数进行了优化。
【数据】方法：DNS法；pH范围：3–8；温度范围：30–80°C；孵育时间范围：10–80 min；底物浓度范围：2–20 g/L
2.5 金属离子和EDTA的影响
阳离子和乙二胺四乙酸对粗内切葡聚糖酶的影响通过以下方式测定：在标准酶-底物（CMC）混合物中加入2.0 mM相应阳离子盐，在标准测定条件（pH 5、70°C、孵育30 min）下孵育。所研究的盐包括MgSO₄·7H₂O、MnSO₄·5H₂O、CuSO₄·7H₂O、CaCl₂、FeSO₄·7H₂O和NaCl。阳离子螯合剂EDTA对酶活性的影响也通过向酶-底物混合物中加入10.0 mM EDTA进行测定。
【数据】阳离子盐浓度：2.0 mM；EDTA浓度：10.0 mM；pH：5；温度：70°C；孵育时间：30 min；底物：CMC；所研究盐类：MgSO₄·7H₂O、MnSO₄·5H₂O、CuSO₄·7H₂O、CaCl₂、FeSO₄·7H₂O、NaCl
2.6 酶稳定性
金属离子对酶稳定性的影响通过将酶与选定的两种矿物质预孵育1小时来研究，残余活性在70°C、pH 5条件下测定20 min，以CMC为底物，浓度为16 g/L。常规活性也在相同条件下测定，使用仅预孵育3分钟的酶。
【数据】预孵育时间：1小时/3 min；温度：70°C；pH：5；测定时间：20 min；底物：CMC；底物浓度：16 g/L
2.7 动力学分析
使用Lineweaver–Burk图测定粗真菌纤维素酶和商业纤维素酶的米氏常数（Km和Vmax）。商业酶制剂使用来自微生物（真菌）来源的商业纤维素酶粉末，品牌为“Bioven ingredients”，印度产品。
【数据】分析方法：Lineweaver–Burk图；商业酶来源：微生物（真菌）来源“Bioven ingredients”品牌印度产品
2.8 孢子悬液制备
从PDA平板上收获真菌孢子，使用血细胞计数板标准化至2×10⁸孢子/mL。
【数据】孢子浓度：2×10⁸孢子/mL；计数工具：血细胞计数板；来源：PDA平板
2.9 纤维素废弃物的生物降解
混合柚木和决明叶片（1:1）在实验室规模（10 g/平板）和堆肥堆（20 kg/堆）装置中用孢子悬液处理。使用黑曲霉、绿色木霉和哈茨木霉的孢子悬液进行有机植物基固体废弃物的生物转化。同时维持未添加孢子悬液的对照平板和对照堆。每15天接种一次，共接种三次。平板和堆中全程维持水分含量。每10天测量温度，平板和堆中内容物每周翻动一次以确保好氧条件。失重百分比使用以下公式计算：
失重（%）= (W - W₁) / W × 100
其中W为初始重量，W₁为最终重量。植物废弃物的失重每30天观察一次（平板）和每10天观察一次（堆），持续60天。
【数据】叶片混合比例：柚木:决明=1:1；平板规模：10 g/平板；堆规模：20 kg/堆；真菌：黑曲霉、绿色木霉、哈茨木霉；接种频率：每15天一次，共3次；温度测量间隔：10天；翻动频率：每周一次；平板失重观察间隔：30天；堆失重观察间隔：10天；观察总时长：60天；计算公式：失重(%)=(W-W₁)/W×100
2.10 统计分析
所有实验均设三个重复，对所有数值估计进行统计分析，使用带标准误差棒的均值绘制图表。数据采用单因素方差分析，其中Tukey多重比较检验用于确定p<0.05水平下的显著性差异。
【数据】重复数：3；统计方法：单因素方差分析+Tukey多重比较检验；显著性水平：p<0.05
研究结果
3.1 真菌分离与筛选
CMC琼脂平板上发生CMC水解的区域在菌落周围清晰可见为黄色透明圈，与红色背景形成对比。刚果红与完整的糖苷键结合呈红色，而纤维素酶水解活性使糖苷键断裂的区域无法结合染料，呈黄色透明圈（图1）。每个HC值表示为均值±标准差（n=3），同一列中不同上标字母的数值差异显著（p<0.05）。所研究的真菌物种包括曲霉属、青霉属、弯孢属、毛霉属和木霉属，均表现出纤维素分解活性。黑曲霉的HC最高（4.58）——见表1。
【数据】HC值：黑曲霉4.58（最高）；其他真菌：曲霉属、青霉属、弯孢属、毛霉属、木霉属；重复数：n=3；显著性：p<0.05
3.2 不同条件对纤维素酶活性的影响
pH的影响见图2，温度的影响见图3，孵育时间的影响见图4，底物浓度的影响见图5。黑曲霉粗纤维素酶在pH 5.0、70°C时表现出最大活性。商业纤维素酶的最适条件为pH 4.8、温度50°C。当底物浓度在pH 5、70°C、60 min孵育条件下从2 g/L变化至20 g/L时，酶活性随底物浓度显著增加，在约16 g/L时达到最大。在较低浓度下，酶活性呈急剧上升，而在较高浓度下活性趋于平稳，表明底物饱和（图5）。两种酶的最适底物浓度和孵育时间分别为16 g/L和60 min。
【数据】黑曲霉粗酶最适pH：5.0；黑曲霉粗酶最适温度：70°C；商业酶最适pH：4.8；商业酶最适温度：50°C；底物浓度范围：2–20 g/L；最适底物浓度：16 g/L；最适孵育时间：60 min；底物饱和浓度：约16 g/L
3.3 金属离子的影响
Mn²⁺和Fe²⁺显著增强酶活性（刺激率分别为144.47%和34.26%）。EDTA和Na⁺表现出抑制作用（表2）。这种刺激作用表明它们在优化性能方面具有潜在作用。这意味着水解产物产量显著增加。Mn可能是酶复合物的组成部分。EDTA作为二价金属离子螯合剂对酶活性的强抑制作用，可能是由于从酶复合物中去除了Mn离子。
【数据】Mn²⁺刺激率：144.47%；Fe²⁺刺激率：34.26%；抑制剂：EDTA、Na⁺
3.4 酶稳定性
黑曲霉纤维素酶在与2 mM Mn²⁺和Fe²⁺预孵育3分钟和1小时后的酶单位活性显示，与Mn²⁺预孵育1小时后保留了>75%的活性，表明Mn²⁺具有强稳定性（图6）。
【数据】金属离子浓度：2 mM；预孵育时间：3 min和1小时；Mn²⁺预孵育1小时后残余活性：>75%
3.5 真菌与商业纤维素酶的动力学比较
这些结果表明，真菌纤维素酶具有更强的底物亲和力，Km值较低为0.9432 g/L，催化效率较高为1.1078 mg mL⁻² min⁻¹，优于微生物来源的商业纤维素酶（表3）。这与一项研究结果一致，该研究中青霉（Penicillium chrysogenum）粗胞外酶制剂的纤维素酶活性与来自黑曲霉株的商业纤维素酶制剂的活性相当。
【数据】黑曲霉纤维素酶Km：0.9432 g/L；黑曲霉纤维素酶Vmax：1.1078 mg mL⁻² min⁻¹；商业纤维素酶Km：7.3510 g/L；商业纤维素酶Vmax：0.7657 mg mL⁻² min⁻¹
3.6 生物降解研究
在对照中，与处理的平板和堆相比，平板（图10）和露天堆（图11）中的生物降解缓慢且失重较低。在真菌孢子接种的平板和堆肥堆中均产生了黑色纤维状、气味良好的堆肥。研究结果与先前研究一致。本研究的一个关键创新在于综合整合了酶动力学、金属离子调控和真实规模的生物降解性能，使用丝状真菌尤其是黑曲霉。虽然真菌纤维素酶已被广泛研究，但很少有报道同时将动力学优越性（低Km和高Vmax）与增强的热稳定性和金属离子依赖性激活相关联，并在实际堆肥系统中验证这些特性。Mn²⁺不仅刺激纤维素酶活性，而且在长时间预孵育过程中显著提高酶稳定性，这为酶-辅因子相互作用提供了新见解，直接与工业生物过程优化相关。Mn²⁺作为激活剂和稳定剂的双重作用表明，靶向金属补充可以显著降低酶用量需求，从而提高大规模生物质转化的经济可行性。本工作的另一个创新贡献是在相同操作条件下，使用合成（CMC）和天然植物基底物直接比较粗真菌纤维素酶和商业纤维素酶。黑曲霉纤维素酶的优越催化效率，加上对复杂植物底物的增强活性，突出了使用粗胞外真菌酶系统相对于纯化商业制剂的优势。此外，实验室规模酶效率成功转化为加速堆肥和显著生物质失重（在平板和堆系统中），弥合了台架规模酶表征与现场级废物管理应用之间的关键差距。因此，本研究推进了真菌纤维素酶作为多功能生物催化剂的概念，不仅适用于生物燃料生产等受控工业过程，也适用于分散式、低成本和环境可持续的城市固体废物管理。总体而言，这些发现将丝状真菌定位为开发下一代生态高效生物转化技术的战略资源。
【数据】黑曲霉平板最大失重率：52%；黑曲霉堆肥最大失重率：55%；降解真菌：黑曲霉、绿色木霉、哈茨木霉；观察时长：60天；对照：未添加孢子悬液
讨论与解读
真菌来源的纤维素酶在广泛的pH、温度和孵育时间范围内表现出稳健的活性，其增强的热稳定性支持工业应用。参数优化结果可用于改善纤维素酶活性。金属离子，尤其是锰，显著刺激酶活性，可用于在需要纤维素生物转化的场景中提高纤维素酶活性。此外，商业纤维素酶显示出类似的多功能性，使用植物材料作为底物比单独使用CMC进一步提高了活性。这些见解强调了真菌来源在可持续酶生产中的潜力。黑曲霉纤维素酶在催化效率上优于商业纤维素酶，其较高的Vmax和较低的Km值证明了这一点。较高的Vmax表明更快的底物处理速率，而较低的Km表明对底物更强的亲和力，即使在较低浓度下也能有效发挥作用。这些特性使黑曲霉纤维素酶成为堆肥和生物燃料生产等需要高效快速底物分解的应用中有前景的酶。真菌接种显著加速了堆肥过程，植物废弃物在60天内出现显著失重，证明了纤维素类城市废弃物的有效生物转化。丝状真菌的纤维素分解酶验证了其作为添加剂的潜在用途。
编译者解读：本研究以土壤筛选为起点，将酶学表征与真实堆肥场景相衔接，方法链条完整。黑曲霉粗酶在动力学参数上超越商业制剂，提示低成本粗酶替代纯化酶的可行性。Mn²⁺兼具激活与稳定双重功能，为减少酶用量提供了可操作策略。不过，研究仅停留在粗酶水平，未涉及酶蛋白纯化与分子改造；堆肥规模也有限，工业化放大时传质与温度控制仍是瓶颈。整体而言，该工作为城市植物废弃物的分散式生物转化提供了有数据支撑的概念验证。
参考来源
期刊：Next Research, 2026
DOI: 10.1016/j.nexres.2026.101791
DOI: 10.1016/j.nexres.2026.101791