黑曲霉AmyR转录因子跨界

来源：Regulatory roles of AmyR in amylolytic enzyme production, cellulose utilization, conidiation, stress tolerance, and fruit decay capacity of Aspergillus niger（Fungal Biology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

Zn(II)2Cys6型转录因子AmyR长期被认为是丝状真菌淀粉降解酶生产的核心调控因子。本研究以黑曲霉RAF106为对象，通过基因敲除与回补、多表型分析和转录水平检测，系统解析了AmyR的生物学功能。结果显示，amyR缺失不仅使总淀粉酶活性下降41.77%、多个糖化酶和α-淀粉酶基因表达显著下调，还意外地提高了羧甲基纤维素酶活性25.89%并增强了纤维素利用能力。此外，amyR缺失严重损害产孢、高渗与氧化胁迫耐受性以及果实腐烂能力。该研究将AmyR的功能从经典的淀粉代谢调控拓展至碳源利用、无性发育和环境适应的多维调控网络。

研究背景

丝状真菌，尤其是曲霉属菌种，凭借强大的水解酶分泌能力被广泛应用于食品发酵和工业加工。其中α-淀粉酶占据全球酶市场约30%的份额，在纺织、食品和造纸等行业举足轻重。AmyR作为Zn(II)2Cys6型转录因子，通过结合淀粉酶基因启动子中的CGGN8(C/A)GG序列来激活转录，从而调控淀粉降解酶的生产。在多种真菌中——包括琉球曲霉、酱油曲霉、米曲霉、黑曲霉、嗜热踝节菌和嗜热毁丝霉——amyR缺失均导致淀粉降解酶活性大幅下降，并伴随淀粉琼脂平板上生长受阻。

然而，既往研究几乎聚焦于AmyR在淀粉代谢中的功能。它在无性发育（产孢）、环境胁迫适应以及果实腐烂等方面的潜在角色，始终未被系统探索。黑曲霉既是重要的工业发酵菌株，也是导致食品腐败和人类致病的机会性病原真菌，阐明AmyR的多维功能对该菌的工业应用与食品安全控制均有参考价值。本研究正是基于这一空白，利用多表型与转录分析手段对AmyR展开功能表征。

研究方法

2.1 微生物菌株与培养条件

野生型（WT）黑曲霉RAF106（CGMCC No. 9608）及其突变体在以下培养基中于30 °C培养，用于真菌生长和产孢：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA；20%马铃薯浸出液、2%葡萄糖、2%琼脂）、沙氏葡萄糖琼脂（SDAY；4%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母提取物、2%琼脂）、察氏琼脂（CZA；3%蔗糖、0.3% NaNO3、0.1% K2HPO4、0.05% KCl、0.05% MgSO4、0.001% FeSO4、2%琼脂）和小麦麸秸秆琼脂（WSA；5.5%稻草粉、3%蛋白胨、0.2% KH2PO4、0.16% (NH4)2SO4、0.02% MgSO4、0.001% CaCl2、0.0002% ZnCl2、0.02%尿素、2%琼脂，pH 5.0）。与环境适应和CAZyme生产相关的表型变化分别在PDA和小麦麸秸秆液体培养基（WSB；WSA的无琼脂配方）中进行评估。大肠杆菌DH5α（Invitrogen，上海，中国）用于质粒扩增，在Lysogeny broth（LB）中于37 °C培养。根癌农杆菌AGL-1作为真菌转化的T-DNA供体，在YEB培养基中于28 °C培养（Fang et al., 2004）。

【数据】菌株：黑曲霉RAF106（CGMCC No. 9608）、大肠杆菌DH5α、农杆菌AGL-1；培养基：PDA、SDAY、CZA、WSA、WSB、LB、YEB；温度：30 °C（真菌）、37 °C（大肠杆菌）、28 °C（农杆菌）；PDA配方：20%马铃薯浸出液、2%葡萄糖、2%琼脂；WSA配方：5.5%稻草粉、3%蛋白胨、0.2% KH2PO4、0.16% (NH4)2SO4、0.02% MgSO4、0.001% CaCl2、0.0002% ZnCl2、0.02%尿素、2%琼脂，pH 5.0

2.2 黑曲霉amyR的克隆与分析

以配对引物（表S1）从WT基因组（NCBI登录号RIBO00000000；Fang et al., 2020）中扩增单一amyR基因，并在Invitrogen（上海，中国）进行测序。推导的蛋白质序列通过在线BLAST工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行分析。分子量（MW）和理论等电点（pI）通过在线工具（https://web.expasy.org/protparam/）预测。

【数据】基因：amyR；NCBI登录号：RIBO00000000；测序公司：Invitrogen（上海，中国）；分析工具：NCBI BLAST、ExPASy ProtParam

2.3 ΔamyR和ΔamyR::amyR的构建

amyR缺失突变体（ΔamyR）通过同源重组生成，方法如前所述（Zhu et al., 2023）。简言之，包含bleo启动子和开放阅读框（赋予博来霉素抗性）的表达盒从pLV-UBC-mCherry-EGFP-CCDC50中以配对引物（表S1）扩增，并使用ClonExpress Ultra One Step Cloning kit（Vazyme Biotech Co., Ltd，南京，中国）克隆到经SacI/XhoI酶切的p0380-hygB中，形成p0380-bleo。amyR的5'和3'片段从WT基因组中扩增，并依次连接到经HindIII/KpnI和XhoI/BglII酶切的p0380-bleo中，分别形成敲除质粒p0380-5' amyR-bleo-3' amyR。对于基因回补，从WT基因组中扩增包含侧翼区域的amyR全长序列（共4534 bp：2065 bp上游侧翼、1945 bp基因主体和524 bp下游侧翼），并使用ClonExpress Ultra One Step Cloning kit克隆到p0380-hygB中，得到回补质粒p0380-hygB-amyR。敲除和回补质粒分别通过农杆菌介导转化导入WT和ΔamyR中。推定转化子分别在含头孢噻肟（300 μg/mL）和潮霉素B（50 μg/mL）或博来霉素（50 μg/mL）的培养基上筛选，并通过PCR和定量实时PCR（qRT-PCR）以配对引物（表S1）进行鉴定。在所有后续实验中，ΔamyR与WT和ΔamyR::amyR作为对照一同评估。

【数据】质粒：p0380-bleo、p0380-5' amyR-bleo-3' amyR、p0380-hygB-amyR；限制性内切酶：SacI、XhoI、HindIII、KpnI、BglII；回补片段全长：4534 bp（上游侧翼2065 bp、基因主体1945 bp、下游侧翼524 bp）；抗生素：头孢噻肟300 μg/mL、潮霉素B 50 μg/mL、博来霉素50 μg/mL；试剂盒：ClonExpress Ultra One Step Cloning kit（Vazyme，南京，中国）

2.4 真菌生长和产孢分析

真菌生长通过点样1 μL孢子悬液（1 × 10⁶ conidia/mL）于PDA、WSA或纤维素培养基平板（直径9 cm）上评估。纤维素培养基上层：1%微晶纤维素、0.5% Triton X-100、1.5%琼脂、2%盐溶液（盐溶液组成：25% KH2PO4、12.5% Na3C6H5O7、10% NH4NO3、1% MgSO4·7H2O、0.5% CaCl2·2H2O）；下层：2%盐溶液、0.5% Triton X-100、1.5%琼脂。30 °C培养3天后，沿两个垂直方向测量菌落直径以评估径向生长。所有实验设三次重复。为评估产孢能力，将100 μL孢子悬液（1 × 10⁶ conidia/mL）均匀涂布于PDA和WSA平板（直径6 cm），30 °C培养5天。用0.02% Tween 80溶液冲洗平板收集孢子。所得孢子悬液涡旋10 min，随后通过四层擦镜纸过滤去除菌丝碎片。用血细胞计数板测定孢子浓度，并换算为每平方厘米菌落面积的孢子数。所有实验设三次重复。此外，为观察分生孢子梗形态，将PDA平板上培养3天的培养物用刀片切片，并如前所述（Cortesão et al., 2022）通过光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM）观察。

【数据】接种量：1 μL孢子悬液（1 × 10⁶ conidia/mL）；培养皿直径：9 cm（生长）、6 cm（产孢）；纤维素培养基上层：1%微晶纤维素、0.5% Triton X-100、1.5%琼脂、2%盐溶液；盐溶液：25% KH2PO4、12.5% Na3C6H5O7、10% NH4NO3、1% MgSO4·7H2O、0.5% CaCl2·2H2O；下层：2%盐溶液、0.5% Triton X-100、1.5%琼脂；培养温度：30 °C；培养时间：3天（生长）、5天（产孢）；孢子收集液：0.02% Tween 80；涡旋时间：10 min；过滤：四层擦镜纸；观察手段：光学显微镜、扫描电子显微镜（SEM）

2.5 总淀粉酶活性和羧甲基纤维素酶（CMCase）活性分析

总淀粉降解酶和CMCase活性按前述方法测定（Zhu et al., 2023）。简言之，将1 mL孢子悬液（10⁸ conidia/mL）接种到100 mL WSB中，30 °C、180 rpm振荡培养3天。培养液离心收集上清。总淀粉酶活性测定：0.05 mL粗酶液与0.45 mL 1%淀粉溶液混合，50 °C孵育30 min。CMCase活性测定：0.05 mL粗酶液与0.95 mL 1%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液（溶于0.05 M柠檬酸钠缓冲液）在50 °C孵育20 min。所有反应通过加入0.75 mL 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂终止，随后煮沸10 min。一个酶活单位（U）定义为在测定条件下每分钟释放1 mmol还原糖（以葡萄糖当量表示）所需的酶量。酶活性以每毫升培养液的单位数表示（U/mL）。所有实验设三次重复。

【数据】接种量：1 mL孢子悬液（10⁸ conidia/mL）；培养基：100 mL WSB；培养条件：30 °C、180 rpm、3天；总淀粉酶反应：0.05 mL粗酶 + 0.45 mL 1%淀粉溶液，50 °C、30 min；CMCase反应：0.05 mL粗酶 + 0.95 mL 1% CMC-Na（0.05 M柠檬酸钠缓冲液），50 °C、20 min；终止试剂：0.75 mL DNS，煮沸10 min；酶活单位定义：每分钟释放1 mmol还原糖（葡萄糖当量）；活性单位：U/mL

2.6 化学胁迫敏感性和果实腐烂能力分析

细胞对化学胁迫的敏感性通过点样1 μL孢子悬液（1 × 10⁴、1 × 10⁵和1 × 10⁶ conidia/mL）于9 cm直径PDA平板及添加不同浓度刚果红（2 mg/mL）、H2O2（6或9 mmol/L）、NaCl（0.8或1.2 mol/L）或KCl（1.2 mol/L）的PDA平板上评估。30 °C培养3天后拍照。所有实验设三次重复。果实腐烂能力在健康果实上评估，包括大小、颜色和重量一致的苹果、梨和桃。果实经无菌水冲洗后用75%乙醇表面消毒，风干。用无菌针在每个苹果上制造三个伤口（直径2 mm、深度3 mm），接种5 μL孢子悬液（1 × 10⁶ spores/mL）。在密封容器中25 °C培养6天后，观察病斑发展并拍照。所有实验设三次重复。

【数据】孢子浓度：1 × 10⁴、1 × 10⁵、1 × 10⁶ conidia/mL；点样量：1 μL；平板直径：9 cm；刚果红：2 mg/mL；H2O2：6或9 mmol/L；NaCl：0.8或1.2 mol/L；KCl：1.2 mol/L；培养温度：30 °C；培养时间：3天；果实种类：苹果、梨、桃；消毒：无菌水 + 75%乙醇；伤口：直径2 mm、深度3 mm、每果3个；接种量：5 μL孢子悬液（1 × 10⁶ spores/mL）；培养温度：25 °C；培养时间：6天

2.7 定量实时PCR（qRT-PCR）

将100 μL孢子悬液（10⁶ conidia/mL）均匀涂布于覆盖玻璃纸的PDA平板（用于产孢相关基因转录表达）、添加0.8 M NaCl的PDA平板（用于耐渗相关基因转录表达）或WSA平板（用于淀粉酶相关基因转录表达）。30 °C培养24 h后，收获菌丝，液氮研磨，使用TRIzol® Reagent（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）提取总RNA。总RNA使用HiScript Ⅲ 1st Stand cDNA Synthesis kit（Vazyme，南京，中国）反转录为cDNA。各cDNA稀释液作为模板，使用SYBR® Premix Ex Taq™（TaKaRa，Kyoto，Japan）和配对引物（表S2）通过qRT-PCR分析测试基因的表达。β-tubulin作为内参。每个基因的相对转录水平定义为其在各突变体中的转录量相对于WT的比值，采用2−ΔΔCt方法计算（Livak and Schmittgen, 2001）。所有实验设三次重复。

【数据】接种量：100 μL孢子悬液（10⁶ conidia/mL）；培养载体：覆盖玻璃纸的PDA平板、添加0.8 M NaCl的PDA平板、WSA平板；培养条件：30 °C、24 h；RNA提取试剂：TRIzol® Reagent（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）；反转录试剂盒：HiScript Ⅲ 1st Stand cDNA Synthesis kit（Vazyme，南京，中国）；qRT-PCR试剂：SYBR® Premix Ex Taq™（TaKaRa，Kyoto，Japan）；内参基因：β-tubulin；计算方法：2−ΔΔCt

2.8 酵母双杂交分析

酵母双杂交实验用于检测AmyR与XlnR之间的相互作用。对照实验证实诱饵质粒pGBKT7-amyR无毒性且不能自激活报告基因（图3D）。同时携带amyR和xlnR的酵母转化子在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上正常生长（图3D），表明两种蛋白之间存在相互作用。

【数据】质粒：pGBKT7-amyR；培养基：SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade；检测蛋白：AmyR与XlnR

研究结果

3.1 黑曲霉AmyR的生物信息学特征

在黑曲霉RAF106基因组中鉴定到单一AmyR，其amyR全长由1945 bp组成，cDNA序列为1833 bp，含两个内含子（分别为51 bp和61 bp）。蛋白质序列包含610个氨基酸，分子量为67.87 kDa，等电点为6.29（图1A）。保守结构域分析表明，AmyR含有一个GAL4样Zn2Cys6双核簇DNA结合结构域和一个真菌转录因子调控中间同源区域，这些结构域在含Zn2Cys6转录因子结构域的蛋白中是保守的（图1B）。序列比对显示，四个AmyR蛋白的N端和中央核心功能结构域高度保守，而序列差异主要集中在C端（图1A）。与黑曲霉CBS 101883的AmyR序列（与黑曲霉CBS 138852相同）相比，黑曲霉RAF106仅存在少量保守氨基酸替换，而黑曲霉CBS 513.8则表现出多个非保守替换和C端截短（图1A）。这一发现提示核心功能区域在进化上保守，而C端充当高度可变热点。

【数据】基因全长：1945 bp；cDNA：1833 bp；内含子：51 bp和61 bp；氨基酸数：610；分子量：67.87 kDa；等电点：6.29；结构域：GAL4样Zn2Cys6双核簇DNA结合结构域、真菌转录因子调控中间同源区域

3.2 amyR在黑曲霉淀粉降解酶生产中的关键作用

通过用bleo表达盒替换amyR编码序列构建敲除突变体（图1C），并通过异位插入其全长片段表达盒进行回补。成功突变体经PCR和qRT-PCR分析确认（图1D–E）。与WT和ΔamyR::amyR相比，ΔamyR的总淀粉酶活性降低41.77%（图2A）。与这一缺陷一致，glaA（编码糖化酶）和六个α-淀粉酶基因（包括amyA、amyC、amyD、amyE、amyG和amyH）的转录水平在ΔamyR中显著下调20.67–72.70%，尽管amyM的表达无显著影响（图2B）。ΔamyR::amyR中的总淀粉酶活性和基因表达恢复至WT水平。此外，在上述七个基因的启动子区域可发现一个或两个AmyR结合基序[CGGN8(C/A)GG]（图2C）。这些发现表明amyR通过直接调控glaA、amyA、amyC、amyD、amyE、amyG和amyH的表达正向控制黑曲霉淀粉降解酶的生产。

【数据】总淀粉酶活性降低：41.77%；基因转录下调：20.67–72.70%；受影响基因：glaA、amyA、amyC、amyD、amyE、amyG、amyH；无显著影响基因：amyM；AmyR结合基序：CGGN8(C/A)GG（每个基因启动子含1–2个）

3.3 amyR在黑曲霉CMCase生产和纤维素利用中的作用

amyR缺失增强了CMCase生产。与WT和ΔamyR::amyR相比，ΔamyR的CMCase活性提高25.89%（图3A）。与活性增加一致，ΔamyR在纤维素平板上生长更好（图3B）。在转录水平上，与WT和ΔamyR::amyR相比，ΔamyR中xlnR、cbhA、eglB、cel6A和cel5A的表达上调37.33–121.33%（图3C）。相反，其他纤维素酶相关基因的表达基本不变（图3C）。此外，酵母双杂交实验检测了AmyR与XlnR之间的相互作用。对照实验证实诱饵质粒pGBKT7-amyR无毒性且不能自激活报告基因（图3D）。同时携带amyR和xlnR的酵母转化子在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上正常生长（图3D），表明两种蛋白之间存在相互作用。总体而言，这些发现提示AmyR可能通过XlnR调控特定纤维素降解基因的表达，从而影响CMCase活性和纤维素利用。

【数据】CMCase活性提高：25.89%；上调基因：xlnR、cbhA、eglB、cel6A、cel5A；上调幅度：37.33–121.33%；酵母双杂交培养基：SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade；诱饵质粒：pGBKT7-amyR

3.4 amyR在黑曲霉产孢中的作用

amyR缺失损害了PDA和WSA平板上的产孢，尽管其生长与WT和ΔamyR::amyR相当（图4A–B和S1A）。与WT和ΔamyR::amyR相比，ΔamyR在PDA平板上培养5天后孢子产量下降42.86%，在WSA平板上下降31.28%（图4C和S1A）。此外，ΔamyR的分生孢子梗更少，且分生孢子梗变得更小、更不饱满（图4D）。进一步地，ΔamyR中fluG、flbA、flbC、flbE、brlA、abaA、vosA和velB的转录水平被抑制38.55–86.69%（图4E），而sfgA和flbD的表达分别上调154.08%和72.17%，其他产孢相关基因的表达与WT和ΔamyR::amyR相当（图4E）。这些发现表明AmyR对黑曲霉产孢具有正向作用，包括孢子产量、分生孢子梗形成与发育以及相关基因的表达。

【数据】PDA孢子产量下降：42.86%；WSA孢子产量下降：31.28%；培养时间：5天；下调基因：fluG、flbA、flbC、flbE、brlA、abaA、vosA、velB，下调幅度38.55–86.69%；上调基因：sfgA（+154.08%）、flbD（+72.17%）

3.5 amyR对黑曲霉胁迫适应和果实腐烂能力的影响

如图5A所示，在添加2 mg/mL刚果红的PDA平板上，初始孢子浓度从1 × 10⁴到1 × 10⁶ conidia/mL范围内，ΔamyR与WT和ΔamyR::amyR生长相似。在H2O2诱导的氧化胁迫下，当接种量为1 × 10⁵ conidia/mL时，ΔamyR在6–9 mmol/L H2O2下表现出生长迟缓。当接种量增加至1 × 10⁶ conidia/mL时，ΔamyR的生长缺陷仅在9 mmol/L H2O2下观察到。对于NaCl诱导的渗透胁迫，无论初始孢子密度如何，所有菌株在0.8 mol/L NaCl下生长相同。相反，在测试浓度范围内，ΔamyR在1.2 mol/L NaCl下表现出明显的生长缺陷。当暴露于1.2 mol/L KCl时，ΔamyR也观察到类似的生长缺陷。伴随耐渗性下降，amyR缺失在NaCl胁迫下使五个关键渗透响应基因（包括ena1、ena2、sho1、nik1和hsp70）的转录水平下调40.67–87.00%（图S1B）。最后，果实腐烂实验揭示，ΔamyR在苹果、梨和桃上引起的病斑小于WT和ΔamyR::amyR引起的病斑（图5B）。综上所述，这些结果表明AmyR调控真菌对高浓度H2O2和高渗透胁迫的耐受性以及黑曲霉的果实腐烂能力。

【数据】刚果红：2 mg/mL，无显著差异；H2O2：6–9 mmol/L（接种量1 × 10⁵ conidia/mL时生长迟缓）、9 mmol/L（接种量1 × 10⁶ conidia/mL时生长缺陷）；NaCl：0.8 mol/L无差异、1.2 mol/L生长缺陷；KCl：1.2 mol/L生长缺陷；渗透响应基因下调：ena1、ena2、sho1、nik1、hsp70，下调幅度40.67–87.00%；果实病斑：ΔamyR < WT和ΔamyR::amyR（苹果、梨、桃）

讨论与解读

AmyR作为丝状真菌碳水化合物活性酶生产和碳源利用的调控因子早已为人所知。本研究在证实其在总淀粉酶活性中关键作用的基础上，进一步揭示了AmyR对CMCase生产、纤维素利用、产孢、高渗与氧化胁迫耐受性以及果实腐烂能力的调控功能。首先，黑曲霉amyR缺失导致总淀粉酶活性下降，这与Zhang等（2016）的报道一致，且在琉球曲霉、酱油曲霉、米曲霉、嗜热踝节菌和嗜热毁丝霉的ΔamyR中也有类似观察。已有证据表明AmyR直接结合淀粉酶基因启动子中的CGGN8(C/A)GG并控制基因表达，如黑曲霉amyA和构巢曲霉amyB。本研究中amyR正向调控glaA、amyA、amyC、amyD、amyE、amyG和amyH的表达，这些基因均含有一或两个AmyR结合基序，其表达在amyR缺失后下降与黑曲霉中的先前发现一致。

值得关注的是amyR缺失反而增强了纤维素利用。这一反直觉现象提示AmyR与XlnR之间存在调控互作——酵母双杂交证实了两者的物理相互作用。AmyR可能通过影响XlnR的活性来调节特定纤维素酶基因的表达，这为理解真菌碳代谢调控网络中转录因子间的交叉对话提供了新线索。

编译者解读：该研究采用经典的基因敲除-回补策略结合多表型分析，方法体系成熟可靠。其最大价值在于打破了AmyR仅调控淀粉代谢的传统认知，揭示了该转录因子在碳源利用切换、发育和环境适应中的多维功能。从合成生物学角度看，amyR启动子中CGGN8(C/A)GG基序的鉴定为淀粉酶基因的定向改造提供了调控靶点，而amyR缺失提升纤维素酶活性的发现则暗示了通过转录调控工程优化黑曲霉纤维素降解能力的可能性。局限在于，AmyR调控产孢和胁迫耐受的具体分子机制尚未阐明，与XlnR互作的信号通路也有待解析。

参考来源

期刊：Fungal Biology, 2026

DOI: 10.1016/j.funbio.2026.101809

DOI: 10.1016/j.funbio.2026.101809