来源：Transcriptomics reveals metabolic division of labor and reproduction-metabolism decoupling in Saccharomyces cerevisiae biofilms（iScience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
生物膜发酵在工业乙醇生产中展现出优于游离细胞发酵的鲁棒性，但其空间代谢逻辑始终未被阐明。本研究对工业条件下酿酒酵母生物膜进行了时空转录组分析，揭示了一种"繁殖-代谢脱偶联"策略：外层细胞充当"代谢盾牌"，激活逆行信号以耐受胁迫并最大化糖酵解；内层细胞则作为"受保护的育婴室"快速增殖。该空间分工为理性设计微生物细胞工厂提供了遗传蓝图。
研究背景
生物膜发酵利用微生物天然形成表面附着群落的特性，已成为工业微生物学的变革性技术。Costerton于1995年将生物膜定义为"被基质包裹、彼此黏附和/或黏附于表面或界面的细菌群体"，此后该概念已扩展至广泛的生物与工业应用。生物膜的自固定化、环境耐受性和增强的代谢活性等特性，使生物膜固定化发酵（BIF）成为工业乙醇生产中传统游离细胞发酵（FCF）的有前景替代方案。实验室与工业规模的比较研究一致表明，BIF在关键性能指标上优于FCF——更高的产物滴度、得率、生产强度和纯度。显著改进包括：大肠杆菌生物膜使L-苏氨酸产量提高53.44%，拜氏梭菌使丙酮-丁醇-乙醇生产强度提高50倍，酿酒酵母使发酵时间消耗减少三分之二。BIF还可实现高效的半连续加工并提高产物纯度。尽管BIF的性能优势已被广泛记录，但其空间代谢逻辑——生物膜内不同空间位置细胞如何分工协作以维持整体鲁棒性——仍然是一个"黑箱"，阻碍了理性的菌株工程改造。
研究方法
菌株与培养基
酿酒酵母1308（S. cerevisiae 1308），一株用于工业生产的产乙醇菌株，在酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂平板上（2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物、2%琼脂）于30°C培养。发酵所用培养基含50 g/L葡萄糖、4 g/L蛋白胨、4 g/L (NH₄)₂SO₄、3 g/L酵母提取物、3 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L MgSO₄、0.05 g/L ZnSO₄·7H₂O和0.05 g/L FeSO₄·7H₂O。
【数据】菌株：S. cerevisiae 1308；培养基：YPD琼脂（2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物、2%琼脂）；培养温度：30°C；发酵培养基：50 g/L葡萄糖、4 g/L蛋白胨、4 g/L (NH₄)₂SO₄、3 g/L酵母提取物、3 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L MgSO₄、0.05 g/L ZnSO₄·7H₂O、0.05 g/L FeSO₄·7H₂O
游离细胞发酵（FCF）
预种子在50 mL离心管中装入5 mL YPD培养基，于30°C、200 rpm培养12 h，然后将预种子转入装有100 mL YPD培养基的250 mL摇瓶中，于30°C、200 rpm培养至细胞群体密度达到3（OD₆₀₀）。培养样品用作发酵种子。FCF以10 mL种子液接入装有100 mL发酵培养基的250 mL摇瓶启动，随后摇瓶于35°C、200 rpm振荡培养。当残留葡萄糖低于1 g/L时发酵结束。
【数据】预种子体积：5 mL；预种子培养：30°C、200 rpm、12 h；扩培体积：100 mL YPD/250 mL摇瓶；扩培条件：30°C、200 rpm至OD₆₀₀=3；接种量：10 mL种子液/100 mL发酵培养基；发酵温度：35°C；转速：200 rpm；终点：残留葡萄糖<1 g/L
生物膜固定化发酵（BIF）
BIF的种子制备过程与FCF相同。BIF发酵以10 mL种子液接入装有100 mL发酵培养基和4 g载体（一种提供细胞黏附的棉纤维）的250 mL摇瓶启动，随后摇瓶于35°C、200 rpm振荡培养。当残留葡萄糖低于1 g/L时，移除发酵液，保留棉纤维载体，向摇瓶中重新加入新鲜培养基。
【数据】接种量：10 mL种子液/100 mL发酵培养基；载体：4 g棉纤维；发酵温度：35°C；转速：200 rpm；补料触发：残留葡萄糖<1 g/L
分析方法
细胞群体密度通过紫外分光光度计测定600 nm光密度（OD₆₀₀）确定。培养上清液中葡萄糖浓度采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法定量。乙醇产量通过气相色谱分析，使用Agilent HP-INNOWAX柱（60 m × 250 μm × 0.5 μm；Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）。甘油浓度通过液相色谱（LC）分析测定，使用有机酸分析柱（BIO-RAD Aminex HPX-87H，300 mm × 7.8 mm），发酵完成后进行适当样品稀释。海藻糖和糖原浓度在发酵终止时测定。
【数据】OD测定波长：600 nm；葡萄糖定量：DNS比色法；乙醇分析：气相色谱，HP-INNOWAX柱（60 m × 250 μm × 0.5 μm）；甘油分析：LC，Aminex HPX-87H柱（300 mm × 7.8 mm）
对于BIF样品，同时收集浮游细胞和载体附着细胞。将载体材料浸入100 mL预冷磷酸盐缓冲液（PBS）中，使用涡旋振荡器（Vibramax 100, 30W, Heidolph）机械破碎10 s以脱落生物膜细胞（BCs）。悬浮液离心，回收细胞称重。使用超声波细胞破碎仪进行细胞破碎（50%振幅，3 s脉冲、7 s间隔，总时长50 min）。海藻糖含量通过LC分析测定，使用Waters Sugar-Pak1柱（Waters, USA）配备示差折光检测器，流速0.5 mL/min，柱温80°C。糖原浓度使用酶法检测试剂盒（EnzyChrom Glycogen Assay Kit, Biotrend, Cologne）按制造商方案双份定量，在Infinite M200 Tecan酶标仪（Crailsheim, Germany）上测量。海藻糖和糖原浓度均以每克干细胞重的代谢物克数表示（g·g⁻¹ DCW）。
【数据】PBS体积：100 mL（预冷）；涡旋破碎：Vibramax 100，30W，10 s；超声破碎：50%振幅，3 s脉冲/7 s间隔，总50 min；海藻糖LC：Sugar-Pak1柱，流速0.5 mL/min，柱温80°C；糖原检测：EnzyChrom试剂盒，双份；单位：g·g⁻¹ DCW
出芽群体通过细胞计数技术测定。样品用无菌水稀释至OD₆₀₀=1，然后向10 mL样品中加入50 μL亚甲基蓝溶液并混匀。将干净的盖玻片覆盖在血细胞计数板上，用滴管吸放数次以确保酵母细胞均匀分布。将充分混匀的稀释液填充血细胞计数板孔。出芽群体测量为出芽细胞数除以总细胞数。细胞死亡率测量为染色细胞数除以总细胞数。细胞凋亡使用TUNEL BrightRed凋亡检测试剂盒（Vazyme, China）按制造商说明评估，通过流式细胞术双份定量分析。
【数据】稀释：无菌水至OD₆₀₀=1；亚甲基蓝：50 μL/10 mL样品；出芽率：出芽细胞数/总细胞数；死亡率：染色细胞数/总细胞数；凋亡检测：TUNEL BrightRed试剂盒，流式细胞术，双份
流式细胞术
酿酒酵母细胞周期分布通过流式细胞术测量细胞DNA含量确定，方法参照Liang等人。收集后，细胞通过离心收集（如5000 rpm、5 min、4°C），弃上清。沉淀用冰冷PBS洗涤并再次离心以确保去除残留培养基。对于细胞固定和透化，缓慢加入预冷70%乙醇（−20°C）重悬细胞，随后冰浴过夜孵育。固定后的细胞通过离心回收（5000 rpm、5 min、4°C），用PBS洗涤，重悬于250 μL PBS中。为消除细胞内RNA干扰，向悬浮液中加入12.5 μL无DNase的RNase A（1 mg/L），然后于37°C水浴孵育40 min。随后用冷PBS洗涤后，细胞用碘化丙啶（PI）在终工作浓度50 μg/mL下避光染色20 min。为确保絮凝生物膜细胞中DNA含量的准确定量，在分析前对悬浮液进行反复机械解离（吹打）以达到单细胞状态。流式细胞术分析使用流式细胞仪（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA）进行。
【数据】离心：5000 rpm、5 min、4°C；固定：70%乙醇（−20°C），冰浴过夜；RNase A：12.5 μL（1 mg/L），37°C、40 min；PI染色：50 μg/mL，避光20 min；仪器：BD流式细胞仪
胞内氨基酸含量分析
收集特定体积的发酵液（含已知生物量），立即于4°C、4000 rpm离心5 min。为去除胞外氨基酸和残留培养基，细胞沉淀用冰冷PBS（pH 7.4）洗涤两次。洗涤后的细胞进行代谢淬灭和提取。然后向细胞沉淀中加入5 mL 80%（v/v）乙醇（预冷至−20°C）。混合物匀浆，使用超声波细胞破碎仪破碎细胞以释放胞内代谢物。悬浮液于80°C孵育10 min，随后于4°C、12000 rpm离心15 min。收集含胞内氨基酸的上清液，通过0.22 μm膜过滤用于进一步分析。提取的胞内氨基酸浓度使用自动氨基酸分析仪（S 7130; Sykam GmbH, Munich, Germany）测定。
【数据】离心：4000 rpm、5 min、4°C；洗涤：冰冷PBS（pH 7.4），两次；提取：5 mL 80%乙醇（−20°C）；超声破碎后：80°C、10 min；离心：12000 rpm、15 min、4°C；过滤：0.22 μm膜；仪器：Sykam S 7130氨基酸分析仪
采样策略与转录组分析
对于FCF，当葡萄糖浓度降至初始糖浓度的四分之三时收集浮游细胞，命名为FP1（SRR32001300）；葡萄糖浓度减半时的浮游细胞命名为FP2（SRR32001299）；葡萄糖浓度降至四分之一时的浮游细胞命名为FP3（SRR32001292）；发酵结束时的浮游细胞命名为FP4（SRR32001291）。对于BIF，考虑到棉纤维载体的复杂几何结构，采用顺序机械脱落方法根据黏附强度分级生物膜亚群。
【数据】FCF采样点：FP1（3/4初始糖）、FP2（1/2初始糖）、FP3（1/4初始糖）、FP4（发酵结束）；样本编号：SRR32001300、SRR32001299、SRR32001292、SRR32001291；BIF采样：顺序机械脱落法分级
研究结果
以下结果中提及的所有主要缩写和操作指标详见表1，并在STAR Methods中进一步详述。
BIF的乙醇生产优于FCF
基于生物膜的生物技术因其优越的发酵性能而快速发展。我们此前的研究表明，BIF相比FCF实现了更高的滴度、得率和生产强度。FCF需要12 h消耗50 g/L葡萄糖生产21.01 g/L乙醇（图1A），而BIF发酵时间随连续批次逐渐缩短，最终稳定在4 h（图1B）。在整个BIF过程中，除首批次外，每批次的滴度均略高于FCF。总体而言，BIF在滴度和得率上表现出适度改善，但在生产强度上有大幅提升（图1C）。细胞活力分析显示，FCF的凋亡水平显著高于BIF（图1D）。两种发酵系统表现出相似的出芽群体动态（图1E）。虽然FCF和BIF的总细胞死亡率相当，但BIF中的浮游细胞死亡率比FCF低约30%（图1F）。在发酵过程结束时，BIF中的浮游细胞（BPCs）和L1细胞从第3批次到第10批次积累了比FCF更高浓度的海藻糖和糖原（图1G和1H）。然而，甘油积累变化极小，BIF仅比FCF多产生0.37 g/L（图1I）。
【数据】FCF：12 h、50 g/L葡萄糖→21.01 g/L乙醇；BIF：稳定至4 h；BIF浮游细胞死亡率比FCF低约30%；甘油差异：BIF比FCF多0.37 g/L；海藻糖/糖原：BIF（BPCs和L1）从第3-10批次高于FCF
生物膜维持转录组稳定性，不同于FCF中游离细胞的"生存恐慌反应"
在全文所有差异表达分析中，均以"实验组 vs. 对照组"呈现，"上调"或"下调"指第一组相对于第二组的状态，除非另有说明。在FCF过程中收集了四个时间样本（FP1、FP2、FP3和FP4）以研究整个发酵过程的转录变化。主成分分析（PCA）揭示了四个样本间的明显聚类模式，表明发酵阶段间存在显著转录差异（图2A）。FCF过程中共鉴定出2,239个差异表达基因（DEGs）（图2B），详细统计分析见表S1。时间分析显示，连续发酵阶段分别有272、213和842个DEGs上调，233、59和1,194个DEGs下调。基因本体（GO）富集分析表明，DEGs主要富集于细胞组分（CC）类别（图2C–2E；表S2）。在FP2 vs. FP1比较中（图2C），FP2中的DEGs在蛋白质生物合成过程上调，包括核糖体生物发生（GO:0042254）、翻译（GO:0006412）和rRNA加工（GO:0006364），支持细胞快速增殖。随着葡萄糖消耗的进行，细胞转向跨膜转运（GO:0055085）、氨基酸跨膜转运（GO:0006865）和氨基酸生物合成途径（GO:0009085、GO:0019878、GO:0009086和GO:0000103）（图2D）。葡萄糖耗尽后，DEGs主要富集于翻译（GO:0006412）和核糖体生物发生（GO:0042254）过程（图2E）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析鉴定了FCF过程中的关键代谢转变，结果分为四个功能组：蛋白质相关、碳相关、氨基酸相关和其他通路（表S3）。在初始阶段（FP2 vs. FP1，图2F），FP2中核糖体通路（ko03010）的基因显著下调（表S2），表明蛋白质生物合成需求降低和资源重新分配至乙醇生产。同时，淀粉和蔗糖代谢（ko00500）中的DEGs上调（图2G；表S2）。硫代谢（ko00920）激活导致半胱氨酸积累，而甲硫氨酸积累与CYS4、STR3、MET6和MTH1上调相对应（图2I）。ADE4下调节约了嘌呤代谢资源，从而减缓细胞生长。随着发酵进行（FP3 vs. FP2，图2G），淀粉和蔗糖代谢（ko00500）进一步激活。糖酵解/糖异生中DEGs上调支持丙酮酸积累，激活丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（ko00250）、精氨酸生物合成（ko00220）和赖氨酸生物合成（ko00300），同时失活硫代谢（ko00920）和半胱氨酸与甲硫氨酸代谢（ko00270）。葡萄糖耗尽后（图2H，FP4 vs. FP3），核糖体相关通路（ko03010核糖体和ko03008真核生物核糖体生物发生）沉默，阻滞细胞周期进程。在这些营养耗尽条件下，淀粉和蔗糖代谢（ko00500）保持活跃以维持葡萄糖稳态，而糖酵解/糖异生（ko00010）和氨基酸代谢（ko00270半胱氨酸与甲硫氨酸代谢、ko00250丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及ko00300氨基酸生物合成）被抑制。
【数据】FCF总DEGs：2,239；FP2 vs. FP1：上调272、下调233；FP3 vs. FP2：上调213、下调59；FP4 vs. FP3：上调842、下调1,194；关键通路：核糖体（ko03010）、淀粉和蔗糖代谢（ko00500）、硫代谢（ko00920）、糖酵解/糖异生（ko00010）；关键基因：CYS4、STR3、MET6、MTH1、ADE4
在BIF过程中收集了五个浮游细胞时间样本（BP1、BP2、BP3、BP4和BP5）。PCA显示BPCs比FCF的浮游细胞（FPCs）聚类更紧密，表明BIF浮游细胞具有更高的转录组稳定性（图2A）。BIF过程中仅鉴定出517个DEGs（图3A），时间上调分别为244、82、13和28个DEGs，对应下调分别为187、12、20和25个DEGs（表S1）。与BP1相比，GO富集分析（表S4）显示BP2中DEGs富集于跨膜转运（GO:0055085），包含34个DEGs，包括糖转运蛋白（HXT13和HXT17）、氨基酸转运蛋白（AGP1和AGP2）和离子转运蛋白（PHO84、ENA1、ENA2和ENA5）。rRNA加工（GO:0006364）和核糖体生物发生（GO:0042254）上调，表明活跃的蛋白质合成。对于CCs，质膜（GO:0005886）包含65个与转运蛋白相关的DEGs，与细胞外周（GO:0071944）的强富集相印证。与BP3相比，BP4维持跨膜转运（GO:0055085）和跨膜转运蛋白活性（GO:0022857）的富集（图3C和3D；表S4）。葡萄糖耗尽后，在高乙醇浓度下发生极小的转录变化。在整个发酵过程中，DEGs主要集中于分子功能（图3E）。KEGG富集分析证实了BPCs相比FPCs的转录稳定性（图3F和3G；表S5）。BP2相对于BP1包含431个DEGs（表S1）。转录组结果表明，碳代谢DEGs下调而氨基酸代谢DEGs上调，促进组氨酸（HIS4）、半胱氨酸（MET17）、甲硫氨酸（MET6）、缬氨酸（ILV2）、苯丙氨酸（ARO1和ARO4）、赖氨酸（LYS20和LYS2）和精氨酸（ARG56、ARG8、ARG1和ARG4）的生物合成，将代谢重定向至氨基酸生物合成（图3K）。BP3和BP4与BP2相比变化极小。BP5（发酵后1 h收集）显示上调DEGs集中于乙醛酸循环通路（图3K）。在整个发酵过程中，糖酵解强度在转录水平保持稳定。在证明BIF转录组稳定性后，对BPCs和L1细胞进行分析以提供互补见解。L1细胞的三个样本（B2I1、B4I1和B5I1）仅产生105个DEGs（图3H），在BIF过程中分别有24和41个上调DEGs以及25和24个下调DEGs（表S1）。比较分析显示，B4I1的DEGs相对于B（原文截断）强烈富集于CC（GO:0005575）和真菌型细胞壁（GO:0009277）。
【数据】BIF总DEGs：517；BP2 vs. BP1：上调244、下调187；BP3 vs. BP2：上调82、下调12；BP4 vs. BP3：上调13、下调20；BP5 vs. BP4：上调28、下调25；BP2 vs. BP1 DEGs：431；L1细胞总DEGs：105；关键转运蛋白基因：HXT13、HXT17、AGP1、AGP2、PHO84、ENA1、ENA2、ENA5；关键氨基酸合成基因：HIS4、MET17、MET6、ILV2、ARO1、ARO4、LYS20、LYS2、ARG56、ARG8、ARG1、ARG4
讨论与解读
BIF中增强的发酵性能与生理鲁棒性
生物乙醇生产传统上依赖FCF，但BIF近年来展现出优越的发酵性能。与先前发现一致，本研究证实BIF显著优于FCF，尤其是在生产强度方面（图1C）。BIF中快速的发酵速率在短时间内产生大量热量，使细胞承受比FCF更大的热胁迫。热胁迫和乙醇胁迫均已知可诱导海藻糖合成作为保护机制，这解释了BIF中观察到的海藻糖水平升高（图1G）。此外，糖原作为发酵效能的关键储备碳水化合物，在BPCs和外层生物膜细胞（BCs, L1）中显著积累（图1H），赋予酵母细胞增强的存活和繁殖优势。与某些包埋固定化系统中糖原积累与G0期细胞周期阻滞相关不同，我们的数据表明在BIF中这些储备支持生物膜结构内的活跃生长、代谢和繁殖。生理分析进一步揭示，BPCs和L1细胞相比FPCs表现出更低的凋亡率和死亡率（图1D和1F），表明生物膜生活方式赋予增强的活力和鲁棒性，这对连续批次发酵至关重要。
编译者解读
该研究以时空转录组学破解了生物膜发酵的"黑箱"，揭示的繁殖-代谢脱偶联策略——外层细胞做盾牌、内层细胞做育婴室——为合成生物学提供了全新的空间编程思路。相比传统的全局代谢工程改造，这种利用细胞自组织空间分工的策略无需额外遗传回路即可实现代谢鲁棒性提升。局限在于当前证据主要基于转录组层面，蛋白和代谢通量的空间验证尚待补充；棉纤维载体的工业放大一致性也需进一步评估。将空间分工逻辑转化为可编程的合成生物学模块，是下一步值得探索的方向。
参考来源
期刊：iScience, 2026
DOI: 10.1016/j.isci.2026.117407
DOI: 10.1016/j.isci.2026.117407