来源：Mining of terpene synthases in fennel (Foeniculum vulgare) and application of limonene and pinene synthase in engineered Escherichia coli（Plant Physiology and Biochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
茴香（Foeniculum vulgare Mill.）是伞形科重要的药食两用植物，其挥发性成分以单萜和倍半萜为主。然而，该物种中萜类生物合成相关基因的鉴定与功能表征研究仍相对有限。本研究通过整合代谢组学与转录组学分析，系统解析了茴香萜类代谢物及其生物合成基因，鉴定出53种萜类代谢物和109个推定萜类合成酶基因，并对5个候选TPS基因进行了功能表征。其中FvTPS1表现出柠檬烯合成酶活性，FvTPS2主要产生α-蒎烯及少量β-蒎烯。摇瓶发酵实验中，柠檬烯产量达到295.75 ± 35.63 mg/L，α-蒎烯产量达到254.01 ± 12.72 mg/L。该研究首次报道了茴香中柠檬烯合成酶和蒎烯合成酶的鉴定，为高价值单萜的代谢工程与工业化生产提供了功能基因资源。
研究背景
茴香（Foeniculum vulgare Mill.）属于伞形科，是一种重要的药食两用植物，广泛应用于香料、制药和食品工业。茴香含有多种生物活性化合物，包括酚类、黄酮类、香豆素、生物碱、萜类、糖苷和鞣质等次生代谢产物。前期研究表明，茴香精油富含30多种单萜和倍半萜化合物，如柠檬烯、蒎烯和茴香脑。这些化合物不仅赋予茴香特征性香气，还具有抗菌、抗氧化和抗炎等多种生物活性。然而，关于茴香中萜类化合物的组织特异性积累模式以及TPS基因的系统鉴定和分子表征研究仍然有限，这严重制约了该物种高价值产品的开发与利用。
萜类化合物是自然界中最大、最多样的植物次生代谢产物类别，包含约25,000种化合物。它们在医药（如抗疟疾的青蒿素）、香精香料工业（如柠檬烯）、农业（如植物激素）和工业应用（如生物燃料）等多个领域具有不可替代的价值。
研究方法
2.1 植物材料、菌株与试剂
茴香（Foeniculum vulgare Mill.）植株种植于中国北京昌平的田间条件下，按需进行常规灌溉。3月份从35日龄植株上分别采集新鲜叶裂片和叶柄，用于代谢组学和转录组学分析（图1A）。每组（小叶和叶柄）包含6个生物学重复（n = 6）。本研究所用菌株和质粒列于补充表S1中。大肠杆菌DH5α感受态细胞用作克隆宿主，大肠杆菌BS1101用作底盘菌株。GC–MS标准品，包括柠檬烯、α-蒎烯和β-蒎烯，购自Sigma-Aldrich。所有其他试剂均为分析纯。石竹烯氧化物（Sigma, W509647）用作定量内标。LB培养基用于大肠杆菌种子培养，SOC培养基用于恢复培养。M9–MOPS培养基用于发酵。必要时，向培养基中添加适当浓度的氯霉素（35 mg/L），并用50 μM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达。培养基组成参照Liu等（2025）的方法配制。
【数据】菌株：大肠杆菌DH5α（克隆宿主）、大肠杆菌BS1101（底盘菌株）；培养基：LB（种子培养）、SOC（恢复培养）、M9–MOPS（发酵）；抗生素：氯霉素35 mg/L；诱导剂：IPTG 50 μM；内标：石竹烯氧化物；植株年龄：35天；生物学重复：n = 6
2.2 茴香叶片代谢组学分析
#### 2.2.1 代谢物提取
称取0.25 g新鲜茴香组织，用1 mL提取溶剂（甲醇:水 = 3:1，v/v）提取。样品在40 Hz下匀浆4 min，随后在冰水浴中超声处理5 min；该匀浆–超声循环重复三次。提取液在4 °C下以12,000 r/min离心15 min，收集上清液并通过0.22 μm滤膜过滤，用于LC–MS分析。对于GC–MS分析，称取0.5 g新鲜茴香组织，用2 mL乙酸乙酯按相同程序提取，分析前过滤。
【数据】组织用量：0.25 g（LC–MS）、0.5 g（GC–MS）；提取溶剂：甲醇:水 = 3:1（v/v）1 mL（LC–MS）、乙酸乙酯2 mL（GC–MS）；匀浆频率：40 Hz；匀浆时间：4 min；超声时间：5 min；循环次数：3次；离心条件：12,000 r/min、15 min、4 °C；滤膜孔径：0.22 μm
#### 2.2.2 GC–MS和LC–MS分析
代谢物检测使用Thermo Scientific TSQ 9000 GC–MS系统和SCIEX QTRAP 6500 LC–MS系统。GC–MS分析中，分离在HP-5MS毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）上完成。进样口温度设为250 °C。氦气用作载气，流速为1.0 mL/min。柱温程序如下：初始温度60 °C保持1 min，以5 °C/min升至250 °C，保持10 min。进样体积为1 μL，分流比为10:1。LC–MS分析中，分离在UPLC Kinetex C18柱（2.1 mm × 100 mm, 2.6 μm）上进行。流动相由溶剂A（水中含0.01%乙酸）和溶剂B（50%乙腈/异丙醇）组成。梯度洗脱程序如下：0–3 min，5% B；3–6 min，5–60% B；6–9 min，60–95% B；9–12 min，5% B。流速为0.3 mL/min，柱温维持在25 °C，进样体积为2 μL。
【数据】GC–MS系统：Thermo Scientific TSQ 9000；LC–MS系统：SCIEX QTRAP 6500；色谱柱：HP-5MS（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）、UPLC Kinetex C18（2.1 mm × 100 mm, 2.6 μm）；进样口温度：250 °C；载气流速：1.0 mL/min；柱温程序：60 °C 1 min → 5 °C/min → 250 °C 10 min；进样体积：1 μL（GC–MS）、2 μL（LC–MS）；分流比：10:1；流速：0.3 mL/min（LC–MS）；柱温：25 °C（LC–MS）；流动相：A（0.01%乙酸水溶液）、B（50%乙腈/异丙醇）
#### 2.2.3 代谢物鉴定与数据分析
所有质谱数据采集和靶标化合物的定量分析均使用百趣生物科技有限公司开发的Biobud自动化数据处理软件完成。GC–MS数据通过与NIST和METLIN数据库比对进行代谢物鉴定注释。主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）使用SIMCA 14.1（V18.0.1）进行，以筛选差异代谢物。差异代谢物的定义标准为VIP > 1、倍数变化 ≥ 2且Q值 < 0.05。此外，进行KEGG通路富集分析以表征茴香中的次生代谢通路。
【数据】分析软件：Biobud（百趣生物）；数据库：NIST、METLIN；统计软件：SIMCA 14.1（V18.0.1）；差异代谢物标准：VIP > 1、fold change ≥ 2、Q value < 0.05
2.3 茴香叶片的Illumina和PacBio转录组测序
#### 2.3.1 RNA提取与质量评估
使用商业RNA提取试剂盒按制造商说明从茴香叶片中提取总RNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性，使用NanoDrop 2000分光光度计评估纯度（A260/A280 = 1.8–2.0），使用Qubit 3.0荧光计测定浓度，以确保适合下游测序。
【数据】琼脂糖凝胶浓度：1%；纯度标准：A260/A280 = 1.8–2.0；仪器：NanoDrop 2000、Qubit 3.0
#### 2.3.2 文库构建、测序与组装
转录组文库按照Illumina和PacBio测序平台的标准方案构建。对于Illumina测序，mRNA被片段化并逆转录为cDNA，随后进行末端修复、接头连接和PCR扩增。测序在Illumina NovaSeq 6000平台上进行，采用双端读长（PE150）。对于PacBio测序，使用SMARTer方法合成全长cDNA，经PCR扩增后连接SMRTbell接头构建文库，在PacBio Sequel II平台上测序。原始Illumina数据经过滤去除接头和低质量读长以获得clean reads。PacBio数据处理生成全长非嵌合（FLNC）读长，并利用Illumina数据进一步纠错。去除冗余序列以获得高质量非冗余转录本集。
【数据】测序平台：Illumina NovaSeq 6000（PE150）、PacBio Sequel II；cDNA合成方法：SMARTer；读长类型：双端PE150、FLNC
#### 2.3.3 基因注释与TPS生物信息学分析
非冗余转录本通过与公共数据库比对进行注释，包括NR、Swiss-Prot、KEGG、GO和COG。使用HMMER软件（v3.3.2）在组装转录组中搜索保守TPS结构域（PF01397和PF03936），以鉴定FvTPS基因。TPS蛋白的氨基酸序列使用MUSCLE进行比对。根据贝叶斯信息准则使用MEGA 12确定最佳拟合氨基酸替换模型。使用JTT + G + I + F模型构建最大似然系统发育树，位点间进化速率差异使用五类离散伽马分布建模，并允许一定比例的不变位点。使用经验氨基酸频率，分支支持率通过1000次bootstrap重复评估。最终树使用iTOL进行可视化和编辑。使用DNAMAN进行多序列比对以分析TPS的保守结构域。此外，通过KEGG通路分析鉴定参与萜类生物合成通路的基因，并使用热图可视化其表达水平。
【数据】软件：HMMER v3.3.2、MUSCLE、MEGA 12、iTOL、DNAMAN；结构域：PF01397、PF03936；模型：JTT + G + I + F；bootstrap：1000次；数据库：NR、Swiss-Prot、KEGG、GO、COG
2.4 茴香TPS基因的分子对接
分子对接使用Discovery Studio中的CDOCKER模块进行。采用AlphaFold3预测TPS的三维结构。蛋白结构通过去除水分子、添加氢原子和能量最小化进行准备。配体香叶基二磷酸（GPP）和法尼基二磷酸（FPP）从PubChem获取。活性位点定义为结合口袋，使用刚性受体–柔性配体方法以CHARMm力场进行对接。对接构象按CDOCKER能量排序，选择最低能量构象进行相互作用分析。Mg²⁺未明确包含在内；因此，对接结果仅作为探索性结构观察进行解读。
【数据】软件：Discovery Studio CDOCKER、AlphaFold3；配体：GPP、FPP（来源PubChem）；力场：CHARMm；Mg²⁺：未包含
2.5 茴香TPS基因的克隆与载体构建
基于5个筛选的TPS候选基因（FvTPS1–FvTPS5）的全长序列，使用TargetP预测信号肽并随后去除。DNA序列和引物针对大肠杆菌进行密码子优化，由华大基因（北京，中国）或擎科生物（北京，中国）合成。Phanta Max Master Mix聚合酶和ClonExpress® II一步克隆试剂盒购自诺唯赞（南京，中国）。按照PCR、限制性酶切、Gibson组装和DNA连接的标准程序进行操作。酶筛选的质粒构建如下：pCC24用作骨架载体（补充表S2），其含有MVA通路异源基因和GPPS基因。使用BamHI限制性位点……
【数据】信号肽预测软件：TargetP；密码子优化：针对大肠杆菌；合成公司：华大基因、擎科生物；试剂：Phanta Max Master Mix、ClonExpress® II；骨架载体：pCC24；限制性位点：BamHI
研究结果
3.1 茴香叶片萜类代谢组学分析
使用GC-MS和LC-MS系统分析了茴香叶片（小叶和叶柄）中的萜类代谢物。萜类代谢物的PCA分析（图1B）显示小叶和叶柄样品在主成分空间中清晰分离，组内聚类紧密，表明这两种组织间的萜类代谢谱存在显著差异。基于倍数变化（log2 FC）筛选，共鉴定出392个显著差异（p < 0.05）代谢物，包括334个上调和58个下调化合物（图1C）。挥发性单萜，如柠檬烯、α-蒎烯和反式-β-罗勒烯，在茴香中显著富集，萜类化合物主要在小叶中积累。次生代谢物的KEGG富集分析（图1D）显示，茴香叶片富集于黄酮类和黄酮醇生物合成，以及芪类、二芳基庚烷类和姜辣素生物合成等通路。此外，还鉴定到与萜类骨架生物合成相关的通路（如倍半萜和三萜生物合成、类胡萝卜素生物合成）以及植物激素信号转导通路。这些结果表明茴香叶片在萜类及其他次生代谢物开发方面具有相当大的潜力。
【数据】差异代谢物总数：392个（上调334个，下调58个）；显著性标准：p < 0.05；萜类代谢物：53种；主要富集通路：黄酮类生物合成、黄酮醇生物合成、芪类/二芳基庚烷类/姜辣素生物合成、倍半萜和三萜生物合成、类胡萝卜素生物合成；主要积累组织：小叶
3.2 叶片中萜类生物合成相关基因的表达模式
为进一步阐明茴香叶片中萜类化合物的积累机制，分析了参与萜类生物合成的基因表达模式。茴香中萜类生物合成主要依赖两条通路：MVA通路和MEP通路，二者共同产生前体分子IPP和DMAPP，最终由TPS催化形成单萜。MVA通路中的关键酶基因（如FvAACT、FvHMGS、FvHMGR、FvMK、FvPMK和FvMVD）和MEP通路中的核心酶基因（如FvDXS、FvDXR、FvMCT、FvCMK、FvMDS、FvHDS和FvHDR）在小叶中的表达水平高于叶柄，表明胞质和质体中的萜类前体生物合成在小叶中更为活跃。FvIDI基因家族成员在两种组织中均有表达，进一步确保了下游单萜生物合成所需的IPP/DMAPP供应。此外，小叶中MVA和MEP通路的协同上调可能为柠檬烯和α-蒎烯等挥发性单萜的合成提供了充足的前体，表明小叶是茴香中萜类生物合成和积累的主要部位。这一观察结果与代谢组学数据显示的柠檬烯和α-蒎烯在小叶中显著富集相一致。
【数据】通路：MVA通路、MEP通路；MVA关键基因：FvAACT、FvHMGS、FvHMGR、FvMK、FvPMK、FvMVD；MEP核心基因：FvDXS、FvDXR、FvMCT、FvCMK、FvMDS、FvHDS、FvHDR；前体分子：IPP、DMAPP；表达趋势：小叶 > 叶柄
3.3 茴香TPS的系统发育分析、表达模式与功能表征
基于茴香转录组，去除冗余序列后鉴定出5个推定TPS基因（图S2），并与已表征的TPS一起构建了系统发育树（图3A）。系统发育分析显示，FvTPS1–FvTPS4属于TPS-b亚家族，与来自薄荷和工业大麻等物种的柠檬烯合成酶以及迷迭香的β-蒎烯合成酶亲缘关系密切。此外，FvTPS2和FvTPS3与单萜合成酶聚类，包括来自刺五加的柠檬烯合成酶。所有5个FvTPS基因在小叶和叶柄之间均表现出组织特异性表达（图3B）。FvTPS1、FvTPS2和FvTPS4在小叶中富集，而FvTPS3和FvTPS5在叶柄中富集。保守基序分析（图3C）表明FvTPS5是倍半萜合成酶，而FvTPS1–FvTPS4四个蛋白包含TPS的典型保守结构域，包括RRx8W、RXR和DDxxD。这些特征表明FvTPS1–FvTPS4可能是功能完整的TPS。
【数据】候选TPS基因数：5个；亚家族：TPS-b（FvTPS1–FvTPS4）；保守结构域：RRx8W、RXR、DDxxD（FvTPS1–FvTPS4）；组织特异性：FvTPS1/FvTPS2/FvTPS4富集于小叶，FvTPS3/FvTPS5富集于叶柄；FvTPS5类型：倍半萜合成酶
3.4 分子对接分析
为探索GPP或FPP在FvTPS1–FvTPS5预测结合口袋中的可能容纳情况，使用Discovery Studio中的CDOCKER模块进行分子对接。FvTPS1和FvTPS2的CDOCKER相互作用能分别为−6.70和−9.75 kcal/mol，而FvTPS3显示出较不利的得分4.46 kcal/mol（图3D）。FvTPS5对FPP也显示出不利的对接得分（45.68 kcal/mol）（图S3）。二维相互作用分析显示，FvTPS1主要通过His558的静电吸引和Ala563的常规氢键稳定底物，并有多重疏水残基和范德华相互作用的支持（图S4）。FvTPS2依赖Lys211进行静电锚定，Pro22、Val212和其他残基的疏水相互作用提供额外稳定。FvTPS3表现出相对密集的相互作用网络，其中Lys208、His525和Asp521参与氢键和静电相互作用，可能有助于底物活化和稳定。FvTPS4通过Lys73的静电相互作用和Gly69的氢键稳定底物。相比之下，FvTPS5与底物的相互作用有限，主要涉及Lys820和Met827的静电和氢键相互作用，缺乏良好协调的相互作用网络。
【数据】CDOCKER相互作用能：FvTPS1 = −6.70 kcal/mol；FvTPS2 = −9.75 kcal/mol；FvTPS3 = 4.46 kcal/mol；FvTPS5对FPP = 45.68 kcal/mol；关键残基：FvTPS1（His558、Ala563）、FvTPS2（Lys211、Pro22、Val212）、FvTPS3（Lys208、His525、Asp521）、FvTPS4（Lys73、Gly69）、FvTPS5（Lys820、Met827）
3.5 FvTPS基因的功能表征与发酵产物验证
为表征FvTPS1–FvTPS5的功能并评估其生物合成和工业应用潜力，构建了原核表达系统。将FvTPS1–FvTPS5基因分别克隆到线性化的pCC24载体中，转化到大肠杆菌工程菌株BS1101中，同时使用携带pCC24载体的菌株作为阴性对照。在100 mL摇瓶发酵系统中用IPTG诱导72 h后，收集发酵产物并通过GC–MS分析。产物峰通过与NIST质谱数据库和萜类化合物真实标准品比对进行定性鉴定，并使用pCC24对照消除宿主代谢的背景干扰（图4G）。结果证实FvTPS1催化形成柠檬烯，而FvTPS2主要产生α-蒎烯，同时产生少量β-蒎烯（图4A–F）。为进一步定量评估催化效率和产物产量，进行了三次独立平行发酵实验（n = 9）。在100 mL摇瓶条件下，表达FvTPS1的工程菌株柠檬烯产量为295.75 ± 35.63 mg/L，相应的细胞密度为OD600 = 5.21。表达FvTPS2的菌株α-蒎烯产量为254.01 ± 12.72 mg/L，相应的OD600为5.71（图4H和I）。
【数据】发酵体系：100 mL摇瓶；诱导剂：IPTG；诱导时间：72 h；平行实验：3次（n = 9）；FvTPS1产物：柠檬烯，产量295.75 ± 35.63 mg/L，OD600 = 5.21；FvTPS2产物：α-蒎烯（主要）+ β-蒎烯（少量），产量254.01 ± 12.72 mg/L，OD600 = 5.71；鉴定方法：GC–MS、NIST数据库、真实标准品
讨论与解读
茴香在食品调味、香精、制药和精油工业中具有重要的经济价值。然而，与其天然产物相关的生物信息学资源仍然有限，在一定程度上阻碍了萜类及其他次生代谢产物生物合成的分子机制解析以及功能化合物的开发与利用。前期研究主要集中于使用GC–MS鉴定挥发性成分，尤其是种子精油，而对新鲜叶片的研究相对较少。Liu等（2024）采用SPME结合气相色谱–质谱–嗅闻法分析了新鲜茴香及其微型蔬菜中的关键香气化合物，在芽苗和成熟叶片中分别鉴定出28和32种化合物。然而，单一GC–MS方法不足以全面检测高分子量萜类和其他有价值的代谢物，挥发性代谢物的组织特异性进一步限制了其覆盖范围。GC–MS与LC–MS联合方法克服了单一分析方法的局限，能够全面检测不同极性的萜类代谢物，提高鉴定准确性和覆盖度。本研究共鉴定出53种萜类代谢物（图1），其中单萜……
编译者解读
该研究采用代谢组+全长转录组+异源表达的经典组合策略，从茴香中挖掘到5个TPS基因并完成功能验证，其中FvTPS1和FvTPS2的产物产量（295.75 mg/L柠檬烯、254.01 mg/L α-蒎烯）在摇瓶水平已具备一定工业化潜力。方法上的亮点在于将分子对接作为候选基因功能预筛工具，但对接未纳入Mg²⁺辅因子，结果仅作探索性参考。局限在于仅在大肠杆菌中完成了初步发酵验证，未涉及蛋白纯化与酶动力学表征，也未在植物体内验证基因功能。从合成生物学视角看，该研究为单萜类高值化合物的微生物细胞工厂构建提供了可用的酶元件，后续可通过途径优化和发酵工艺改进进一步提升产量。
参考来源
期刊：Plant Physiology and Biochemistry, 2026
DOI：10.1016/j.plaphy.2026.111575
DOI: 10.1016/j.plaphy.2026.111575