来源：Systemic metabolic rebalance and regulatory network reconstruction drive high-yield production of sucrose isomerase by nutrient deficient Bacillus amyloliquefaciens（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
蔗糖异构酶是食品工业中生产异麦芽酮糖的关键酶，但安全高效的食物级表达系统开发仍面临挑战。本研究以解淀粉芽孢杆菌为宿主，基于D-丙氨酸营养缺陷互补构建无抗生素表达系统。通过阐明消旋酶基因alr1和alr2的生理功能、下调选择标记表达提升质粒拷贝数与稳定性、共表达ald基因重塑胞内L/D-丙氨酸稳态、定点突变cre元件解除碳分解代谢阻遏等系统策略，最终在200 L规模发酵中实现1527.23 U/mL的蔗糖异构酶活性，较此前食物级宿主最高水平提升1.77倍。
研究背景
全球健康意识提升与减糖趋势的双重驱动下，新型低热量功能性甜味剂的开发已成为食品生物技术的研究热点。异麦芽酮糖作为蔗糖的同分异构体，因低血糖指数、非致龋性及促进脂肪氧化等优良生理特性被视为理想替代品，在食品和制药领域的需求激增。与高污染、低产率的化学合成相比，工业异麦芽酮糖生产主要利用微生物蔗糖异构酶转化蔗糖。然而，低成本、大规模的异麦芽酮糖生产高度依赖高效、稳定且符合食品安全要求的微生物细胞工厂。解淀粉芽孢杆菌作为公认安全的GRAS底盘，在食品级酶制剂的分泌表达方面具有天然优势。染色体整合虽能确保外源基因的稳定遗传，但低基因拷贝数通常限制表达效率，难以满足工业生产需求。因此，基于游离质粒系统的多拷贝基因扩增仍是当前目标蛋白高效表达不可或缺的策略。但工业高产发酵中质粒不稳定等问题制约着食物级表达系统的应用。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
本研究所用菌株和质粒见表S1，所用引物见表S2。大肠杆菌JM109和大肠杆菌EC135/pM.Bam分别用于质粒构建和DNA甲基化。所有菌株均在LB培养基中、37 °C、220 rpm条件下培养。需要时，向培养基中添加卡那霉素（终浓度50 μg/mL）或壮观霉素（终浓度100 μg/mL）。发酵培养基制备如下：首先，将60 g/L豆饼粉在pH 12、50 °C条件下溶解2 h。其次，待温度冷却至25 °C后，加入30 g/L葡萄糖、4 g/L磷酸二氢钠和0.3 g/L磷酸二氢钾。最后，用磷酸将pH调节至7.3。
【数据】培养基：LB（菌株培养）、发酵培养基（60 g/L豆饼粉、30 g/L葡萄糖、4 g/L磷酸二氢钠、0.3 g/L磷酸二氢钾）；温度：37 °C（培养）、50 °C（豆饼粉溶解）、25 °C（冷却）；转速：220 rpm；pH：12（溶解）、7.3（发酵培养基）；抗生素浓度：卡那霉素50 μg/mL、壮观霉素100 μg/mL；时间：2 h（豆饼粉溶解）
2.2 用于解淀粉芽孢杆菌sgRNA表达的pWH-T2-sgRNA构建
以alr1基因敲除为例，使用CRISPR RGEN Tools网站（http://www.rgenome.net/cas-designer/）在线设计gRNA。使用P amy -F/R引物从pLY-3中扩增P amy 启动子。使用sgRNA-alr1-F和sgRNA-alr1-R引物组装N20-sgRNA-alr1构建体。分别使用引物alr1-up-F/alr1-up-R和alr1-down-F/alr1-down-R从解淀粉芽孢杆菌基因组中扩增上游和下游同源臂（alr1-up和alr1-down）。将组装片段P amy -N20-sgRNA-alr1-up-down插入经Xba I和Sma I消化的pWH-T2载体中，生成pWH-T2-sgRNA-alr1。靶向alr2的敲除质粒（pWH-T2-sgRNA-alr2）采用相同方法构建。
【数据】菌株：解淀粉芽孢杆菌；质粒：pWH-T2、pLY-3；限制性内切酶：Xba I、Sma I；靶基因：alr1、alr2；在线工具：CRISPR RGEN Tools；其他参数：原文未详述
2.3 敲除菌株构建
基因敲除按照已建立的CRISPR/Cas9n系统方案进行。将双质粒CRISPR/Cas9n系统转化至解淀粉芽孢杆菌感受态细胞中。通过PCR扩增和Sanger测序验证成功的基因组修饰。pWH-T2-sgRNA为温度敏感型质粒，以rpeF为复制子，可通过在45 °C孵育消除。Cas9n表达质粒pHY300PLK-Cm-Cas9n可在无抗生素条件下培养2–3代后丢失。
【数据】菌株：解淀粉芽孢杆菌；质粒：pWH-T2-sgRNA、pHY300PLK-Cm-Cas9n；温度：45 °C（质粒消除）；传代次数：2–3代（Cas9n质粒丢失）；验证方法：PCR扩增、Sanger测序；其他参数：原文未详述
2.4 生长测定
在30 h内监测解淀粉芽孢杆菌及其突变体的生长情况。从LB琼脂平板上挑取单菌落，接种至5 mL LB液体培养基中制备种子培养液。随后将种子培养液转接至50 mL LB液体培养基中，初始OD600为0.1。使用自动生长曲线分析系统每3 h追踪细菌生长。
【数据】菌株：解淀粉芽孢杆菌及其突变体；培养基：LB；初始OD600：0.1；种子液体积：5 mL；转接体积：50 mL；监测时间：30 h；监测间隔：3 h；其他参数：原文未详述
2.5 蔗糖异构酶活性测定
使用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH 6.0）配制250 g/L蔗糖溶液。将800 μL该溶液在35 °C预热10 min后，加入200 μL稀释酶液。混合物在35 °C孵育10 min，加入2 mL DNS（3,5-二硝基水杨酸）溶液终止反应，随后沸水浴5 min。冷却至室温后，测定OD540吸光度。以煮沸酶液作为空白对照。一个单位蔗糖异构酶活性（U/mL）定义为在上述条件下每分钟产生1 μmol异麦芽酮糖所需的酶量。
【数据】缓冲液：磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH 6.0）；底物浓度：250 g/L蔗糖；温度：35 °C；预热时间：10 min；反应时间：10 min；终止剂：2 mL DNS；沸水浴时间：5 min；检测波长：OD540；酶活定义：每分钟产生1 μmol异麦芽酮糖为1 U/mL
2.6 转录水平测定
收集对数中期和稳定期细菌细胞，使用RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit（天根，北京，中国）提取总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，美国）评估RNA完整性和浓度。随后，使用FastQuant RT Kit（天根）将1 μg总RNA逆转录为cDNA。使用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（天根）在LightCycler® 96系统（Roche，瑞士）上以cDNA为模板进行实时定量PCR。以16S rRNA基因作为内参，反应方案遵循试剂盒说明。每个样品设三个重复，目标基因的相对转录水平使用2^-ΔΔCt方法计算。
【数据】RNA提取试剂盒：RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit；RNA用量：1 μg；逆转录试剂盒：FastQuant RT Kit；qPCR试剂：SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）；仪器：LightCycler® 96系统、NanoDrop 2000；内参基因：16S rRNA；重复数：3；计算方法：2^-ΔΔCt
2.7 翻译起始效率预测
使用RBS Calculator v2.0（https://salislab.net/software/）理论预测每个核糖体结合位点（RBS）的翻译起始效率。简言之，将含有单个RBS元件的5‘非翻译区（5’-UTR）序列和目标基因的下游编码序列（CDS）提交至该统计热力学模型。软件计算与翻译起始相关的自由能变化并输出相对起始速率，作为评估每个RBS强度的定量指标。
【数据】软件：RBS Calculator v2.0；输入序列：含RBS的5‘-UTR和下游CDS；输出指标：相对起始速率；其他参数：原文未详述
2.8 质粒拷贝数测定
通过实时定量PCR绝对定量法测定质粒拷贝数。以解淀粉芽孢杆菌单拷贝染色体基因gyrB作为内参，选择质粒复制起始蛋白基因repB作为目标基因。发酵36 h后收集细菌细胞，使用TIANamp Bacteria DNA Kit（天根，北京，中国）提取总DNA。将PCR扩增的repB和gyrB片段克隆至pMD18-T载体（Takara，大连，中国）并转化至大肠杆菌DH5α；提取重组质粒作为标准品。浓度测定后，将标准质粒进行10倍梯度稀释（10³–10⁸ copies/μL）制备标准曲线。使用SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit（Accurate Biology，湖南，中国）在LightCycler® 96系统（Roche，瑞士）上进行扩增。根据标准曲线计算各样品中repB和gyrB的绝对拷贝数，质粒拷贝数以repB与gyrB的比值表示。
【数据】内参基因：gyrB；目标基因：repB；发酵时间：36 h；标准品载体：pMD18-T；标准曲线范围：10³–10⁸ copies/μL；稀释梯度：10倍；qPCR试剂：SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit；仪器：LightCycler® 96系统；计算公式：repB/gyrB比值
2.9 质粒稳定性
使用平板菌落计数法评估发酵过程中质粒稳定性。每12 h取样，梯度稀释后涂布于两种平板：无抗生素或添加剂的LB平板（检测携带质粒的细胞）和添加D-丙氨酸的LB平板（测定总活菌数）。在37 °C孵育12 h后记录菌落数，质粒稳定性按以下公式计算：S = NA/NB × 100%。公式中NA和NB分别对应LB琼脂平板和D-丙氨酸琼脂平板上的单菌落计数结果。
【数据】取样间隔：12 h；平板类型：LB平板（无抗生素）、LB+D-丙氨酸平板；孵育温度：37 °C；孵育时间：12 h；计算公式：S = NA/NB × 100%
2.10 胞内L-丙氨酸和D-丙氨酸浓度测定
将解淀粉芽孢杆菌发酵液离心（13,000 ×g，10 min）收集菌体。用0.01 M PBS洗涤细胞两次，重悬于相同缓冲液中，在冰水浴中使用超声波细胞破碎仪裂解。裂解液离心（13,000 ×g，10 min，4 °C）去除碎片，上清液经0.22 μm滤膜过滤后进行HPLC分析。使用Agilent 1100 HPLC系统测定胞内L-丙氨酸浓度。过滤后的提取液经衍生化后，在Phenomenex Gemini 5 μm C18柱（250 × 4.6 mm）上于33 °C分离。流动相为50 mmol/L乙酸钠溶液中含50%乙腈，流速1.0 mL/min，检测波长360 nm。D-丙氨酸通过配体交换色谱在Chirex® 3126 (D)-青霉胺柱（250 × 4.6 mm）上于30 °C分析。流动相为2 mM CuSO₄和异丙醇（95:5，v/v），流速1.0 mL/min，检测波长254 nm。
【数据】离心条件：13,000 ×g、10 min（收集菌体）、13,000 ×g、10 min、4 °C（去碎片）；洗涤缓冲液：0.01 M PBS；滤膜孔径：0.22 μm；L-丙氨酸色谱柱：Phenomenex Gemini 5 μm C18（250 × 4.6 mm）；L-丙氨酸柱温：33 °C；L-丙氨酸流动相：50 mmol/L乙酸钠溶液中含50%乙腈；流速：1.0 mL/min；L-丙氨酸检测波长：360 nm；D-丙氨酸色谱柱：Chirex® 3126 (D)-青霉胺柱（250 × 4.6 mm）；D-丙氨酸柱温：30 °C；D-丙氨酸流动相：2 mM CuSO₄和异丙醇（95:5，v/v）；D-丙氨酸流速：1.0 mL/min；D-丙氨酸检测波长：254 nm；仪器：Agilent 1100 HPLC
2.11 发酵
种子培养基含葡萄糖（30 g/L）、豆粕水解液（60 g/L）、磷酸二氢钠（4 g/L）和磷酸二氢钾（0.3 g/L）。将50 mL该培养基置于250 mL锥形瓶中，在37 °C条件下培养。
【数据】种子培养基：葡萄糖30 g/L、豆粕水解液60 g/L、磷酸二氢钠4 g/L、磷酸二氢钾0.3 g/L；装液量：50 mL/250 mL锥形瓶；温度：37 °C；其他参数：原文未详述
研究结果
3.1 解淀粉芽孢杆菌丙氨酸消旋酶基因缺失菌株的构建
解淀粉芽孢杆菌作为公认安全的（GRAS）微生物，在食品和工业酶生产中发挥着关键作用。本研究所用亲本菌株BA1此前已通过系统敲除六个主要胞外蛋白酶基因（vpr、aprE、nprE、bpr、mpr、epr）进行了工程改造，显著降低了异源蛋白降解风险，使其成为理想的蛋白表达宿主。然而，工业菌株的常规工程改造通常依赖抗生素抗性基因作为选择标记，这不仅引入生物安全问题，还限制了其在食品级产品中的应用。为解决这一瓶颈并建立稳定、安全且食品安全的表达系统，本研究聚焦于丙氨酸消旋酶（ALR）——参与肽聚糖生物合成的关键酶，旨在构建基于D-丙氨酸营养缺陷的无抗生素选择系统。通过对BA1进行基因组挖掘和生物信息学分析（结合NCBI和KEGG数据库），鉴定出两个推定的丙氨酸消旋酶基因alr1和alr2。氨基酸序列比对显示这两个基因具有63.53%的同源性（图1a），暗示可能存在功能冗余，尽管它们各自在肽聚糖合成中的贡献尚不清楚。为阐明其生理功能并建立严格依赖D-丙氨酸的营养缺陷型底盘细胞，我们依次敲除了这两个基因。利用本实验室优化的CRISPR/Cas9n基因组编辑系统，实现了目标基因的高效精准敲除。如图S1所示，针对alr1和alr2的保守编码区设计了高特异性sgRNA，并构建了携带上下游同源臂的编辑质粒。在Cas9n诱导DNA单链切割后，细胞通过提供的供体模板进行同源重组修复损伤，实现目标片段的无缝缺失。PCR验证确认alr1精确切除1170 bp，alr2精确切除1182 bp（图1b、c）。随后，通过在无抗生素培养基中45 °C连续传代成功消除了温度敏感型CRISPR/Cas9n质粒，获得两个无标记单基因缺失突变体：BA2（BA1Δalr1）和BA3（BA1Δalr2）。这些菌株为进一步解析丙氨酸消旋酶的生理功能以及通过alr互补开发食品级表达系统奠定了坚实基础。
【数据】菌株：BA1（亲本，六蛋白酶基因敲除）、BA2（BA1Δalr1）、BA3（BA1Δalr2）；敲除基因：alr1、alr2；基因同源性：alr1与alr2氨基酸序列同源性63.53%；alr1切除片段：1170 bp；alr2切除片段：1182 bp；质粒消除温度：45 °C；编辑系统：CRISPR/Cas9n
3.2 丙氨酸消旋酶基因缺失对细菌生长的影响
D-丙氨酸是肽聚糖生物合成的必需前体。它介导肽交联并维持细胞形态和渗透稳定性。为阐明alr1和alr2在BA1中的功能差异，并选择严格的D-丙氨酸营养缺陷型底盘，本研究比较分析了单基因缺失突变体BA2（BA1Δalr1）和BA3（BA1Δalr2）的生长动力学。试管培养揭示了alr1和alr2对细胞生长的不同贡献。如图2a所示，突变体BA2在缺乏D-丙氨酸的LB培养基中完全无法生长。该表型证实alr1编码关键的D-丙氨酸生物合成酶。alr1的缺失阻断了从L-丙氨酸到D-丙氨酸的主要通量，损害了细胞壁合成。剩余的alr2基因在标准培养条件下无法功能性补偿。相反，突变体BA3在无外源D-丙氨酸条件下正常生长，验证了alr2的非必需作用。序列比对显示Alr1与枯草芽孢杆菌Dal具有89.06%的同源性（图2b）。据此，BA2被鉴定为严格的D-丙氨酸营养缺陷型，满足作为食品级应用中无抗生素筛选底盘的遗传要求。这一严格的选择压力在发酵培养基中得到了实验验证：菌株BA2在无外源D-丙氨酸条件下不生长，而添加D-丙氨酸后完全恢复生长（图S2）。这些结果证实营养缺陷型选择系统在工业发酵条件下保持稳健和功能性。为确定营养缺陷型菌株BA2生长恢复的最佳培养条件，并定义D-丙氨酸作为生长限制性底物的代谢阈值，本研究进一步考察了不同D-丙氨酸浓度对BA2生长的影响。实验结果显示，菌株的比生长速率和最大生物量均与补充的D-丙氨酸浓度呈剂量依赖性相关。在0–200 μg/mL范围内，增加外源D-丙氨酸逐渐缓解了细胞壁合成的前体供应瓶颈，使菌株生长性能大幅改善。当D-丙氨酸浓度达到200 μg/mL时，BA2的生长曲线与亲本菌株BA1无显著差异，表明该浓度完全满足细胞壁形成过程中肽聚糖合成的饱和需求。进一步将浓度提高至300–400 μg/mL并未产生额外的生物量增加（图2c）。综合考虑菌株遗传稳定性和营养缺陷所需严格性，本研究确定200 μg/mL为BA2在非互补培养条件下的最佳D-丙氨酸补充水平。
【数据】菌株：BA2（BA1Δalr1）、BA3（BA1Δalr2）、BA1（亲本）；BA2在无D-丙氨酸LB中：完全不生长；BA3在无D-丙氨酸LB中：正常生长；Alr1与枯草芽孢杆菌Dal同源性：89.06%；D-丙氨酸浓度范围：0–200 μg/mL（剂量依赖）、200 μg/mL（最佳补充水平）、300–400 μg/mL（无额外增加）；其他参数：原文未详述
3.3 基于alr1互补的食品级表达系统构建与验证
来自Pantoea dispersa UQ68J的蔗糖异构酶基因（sim）具有转化效率高、副产物少、酸碱耐受性好、反应条件温和等核心优势。这些特性使其成为食品领域工业规模异麦芽酮糖生产的理想生物催化剂。在前期工作中，我们使用pLY-3载体将sim基因克隆至淀粉酶启动子P amyS 下游。由此获得重组质粒pLY-3-P amyS -sim-P kan -kan R，简称为P4（图S3a）。将P4转化至亲本菌株BA1后获得重组菌株BA4。该菌株在抗生素选择下实现了sim在解淀粉芽孢杆菌中的高效异源表达，摇瓶发酵60 h后蔗糖异构酶活性达到142.46 U/mL。为消除抗生素抗性标记并实现蔗糖异构酶的食品级表达，我们以pLY-3为骨架。去除卡那霉素抗性盒，插入sim基因及丙氨酸消旋酶基因alr1，构建质粒pLY-3-P amyS -sim-P 43 -alr1，命名为P5（图S3b）。在该构建体中，alr1由组成型启动子P 43 控制，sim仍受P amyS 控制。随后将重组质粒P5转化至宿主菌株BA2，生成食品级重组菌株BA5。菌株BA5能够在无D-丙氨酸补充的培养基中正常生长。该结果证实质粒携带的alr1成功恢复了D-丙氨酸合成途径并实现了功能互补。摇瓶发酵显示BA5未达到传统抗生素系统的生产水平。发酵48 h后，BA5的蔗糖异构酶活性达到116.84 U/mL，相当于BA4最大活性的82.02%（图3）。质粒稳定性测定显示，P5质粒在发酵后期逐渐丢失，尤其是进入稳定期后（表S3）。这些结果表明，简单的基因互补不足以构建高效细胞工厂。选择标记基因表达的精确调控以匹配宿主代谢需求至关重要。
【数据】菌株：BA4（BA1+P4）、BA5（BA2+P5）；质粒：P4（pLY-3-P amyS -sim-P kan -kan R）、P5（pLY-3-P amyS -sim-P 43 -alr1）；启动子：P amyS （sim）、P 43 （alr1）；BA4蔗糖异构酶活性：142.46 U/mL（60 h摇瓶）；BA5蔗糖异构酶活性：116.84 U/mL（48 h摇瓶）；BA5相对BA4活性：82.02%；质粒稳定性：发酵后期P5逐渐丢失
讨论与解读
本研究突破了传统单基因补充的静态思路，通过系统性重构遗传稳态、碳代谢通量和转录调控，在解淀粉芽孢杆菌中建立了高度稳健的食品级表达底盘。在营养缺陷互补中，标记基因alr1的无限表达导致D-丙氨酸过度泄漏，引发群体水平交叉喂养，这是发酵后期质粒群体丢失的直接原因。为此，采用限速表达策略——利用弱启动子和低效核糖体结合位点（RBS）将D-丙氨酸合成通量严格抑制至生存所需的最低临界阈值。这种定量的代谢微饥饿诱导了细胞的补偿机制，自发将质粒拷贝数提高120%。结果表明，适度的代谢饥饿优于强过表达，能够在无抗生素条件下实现整个发酵周期100%的质粒稳定性。然而，强制D-丙氨酸合成严重耗竭了胞内L-丙氨酸储备（L-Ala/D-Ala比值升至……），进而引发代谢失衡，需通过共表达ald基因重塑胞内L/D-丙氨酸稳态。此外，葡萄糖介导的碳分解代谢阻遏（CCR）限制了发酵效率，通过对P amyS 启动子cre顺式元件进行定点突变，显著削弱了阻遏蛋白CcpA的结合亲和力，转录水平提升2.90倍。最终在200 L规模发酵中，菌株BA24的蔗糖异构酶活性达到1527.23 U/mL，较此前报道的食物级宿主最高水平提升1.77倍。
编译者解读：该研究的方法论价值在于将“代谢微饥饿”概念引入质粒稳定性调控——不是通过强选择压力维持质粒，而是通过限速表达使宿主对质粒产生代谢依赖，这一思路可推广至其他营养缺陷互补系统。系统性地将启动子工程、RBS工程、代谢通路补全和CCR解除整合为一条完整的代谢再平衡策略链，展示了合成生物学“设计-构建-测试-学习”循环在工业菌株改造中的落地范式。局限在于当前策略高度依赖宿主特定的丙氨酸代谢网络，向其他GRAS宿主移植时需重新评估代谢阈值和调控节点。
参考来源
期刊：Chemical Engineering Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.cej.2026.180416
DOI: 10.1016/j.cej.2026.180416