代谢工程改造大肠杆菌以葡萄糖为原料从头合成异戊二醇

来源：Biosynthesis of isoprene glycol from glucose by metabolically engineered Escherichia coli（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：质粒载体构建校验

导读

异戊二醇（ISPG）是化妆品行业广泛使用的保湿剂，目前依赖石油化工路线生产，能耗高且不可持续。本研究在大肠杆菌中构建了从葡萄糖出发的异戊二醇从头合成路径：先将中心代谢物乙酰辅酶A转化为非天然代谢物3-羟基-3-甲基丁酰辅酶A（HMB-CoA），再通过两条不同的还原策略将其转化为异戊二醇。其中羧酸还原酶（CAR）介导的还原路线产量更高。经过酶挖掘和提升胞内辅酶A可用性，最终工程菌株的异戊二醇产量达到2.2 g/L，得率为0.11 g异戊二醇/g葡萄糖。

研究背景

异戊二醇被认证为无味、无刺激且环保的化妆品配方成分。它兼具亲水和亲脂活性，能溶解多种天然产物，包括聚酮、萜类和生物碱，因此被广泛用于化妆品。添加异戊二醇可改善皮肤保湿效果，并与山梨醇一起修复头发的角质层损伤，因此被用作护肤和护发产品的多功能成分。据市场评估报告，2023年异戊二醇市场价值为3.38亿美元。其价格在每公斤10至20美元之间，估计全球年产量约为2万至3万吨。在需求增长的推动下，该市场预计到2029年将达到4.87亿美元。目前异戊二醇通过Prins反应合成，使用来自化石资源的异丁烯和甲醛。基于常规石化前体的反应化学计量，该合成的碳足迹估计高于每公斤异戊二醇1.64 kg CO2当量。这一基准数字仅考虑了原料底物的碳足迹。考虑到该过程需要苛刻的操作条件，其实际环境影响更为显著。因此，建立一种可再生的生物合成路线具有重要的应用价值。

研究方法

2.1 化学品与试剂

所有化学品均购自TCI、J.T. Baker或Sigma-Aldrich，除非另有说明。Q5®高保真DNA聚合酶、Phusion DNA聚合酶和Taq连接酶购自New England Biolabs。T5-核酸外切酶购自Epicentre Biotechnologies。KOD Xtreme DNA聚合酶购自EMD biosciences。由于HMB-CoA和3-MG-CoA无法商业获得，标准品通过酶法合成。HMB-CoA在含有50 mM磷酸钾缓冲液、30 mM HMB、1 mM CoA、5 mM ATP、0.1 mM MgCl2、1 mM DTT和20 ng来自Shewanella frigidimarina的酰基辅酶A合成酶（Acs）的反应混合物中合成。3-MG-CoA通过将1 mM HMG-CoA与20 ng LiuC和1 mM DTT在50 mM磷酸钾缓冲液中孵育产生。两个反应均在30 °C下孵育30分钟或1小时。生成产物的浓度根据各自底物的化学计量减少来确定。所得产物随后用作通过LC-MS/MS进行定性和定量分析的标准品（补充材料）。

【数据】缓冲液：50 mM磷酸钾缓冲液；HMB浓度：30 mM；CoA浓度：1 mM；ATP浓度：5 mM；MgCl2浓度：0.1 mM；DTT浓度：1 mM；Acs用量：20 ng；温度：30°C；时间：30 min或1 h；HMG-CoA浓度：1 mM；LiuC用量：20 ng

2.2 DNA操作

所有质粒均使用Gibson DNA组装方法构建，并在大肠杆菌XL1-blue中扩增。质粒和菌株的详细信息见补充材料。pT7-Bldh由2个片段构建：一个含有从C. saccharoperbutylacetonicum N1–4基因组DNA扩增的bldh基因，另一个是包含PT7启动子、CloDF复制起点和壮观霉素抗性基因的骨架。使用相同方法，用从C. koseri或L. reuteri扩增的pduP替换bldh，构建了质粒pCDF-pduP_Ckos和pCDF-pduP_Lbre。除来自M. marinum的CAR经过密码子优化并由Twist Bioscience合成外，其他CAR同源物均从基因组DNA扩增，包括来自N. iowensis、M. abscessus、M. marinum、M. immunogenum、S. rotundus、S. rugosus、L. tulufanense、K. albida、N. brasiliensis、S. phatthalungensis、A. cihanbeyliensis、M. celatum、M. kyorinense、M. triplex和M. avium的CAR。质粒pET-CAR_Mmar用于扩增包含PT7启动子、ColE1复制起点和卡那霉素抗性基因的片段。通过载体与各自基因片段的连接，构建了pET-CAR_Niow、pET-CAR_Mabs、pET-CAR_Mimm、pET-CAR_Srot、pET-CAR_Srug、pET-CAR_Ltul、pET-CAR_Kalb、pET-CAR_Nbra、pET-CAR_Spha、pET-CAR_Acih、pET-CAR_Mcel、pET-CAR_Mkyo、pET-CAR_Mtri和pET-CAR_Mavi。质粒pWH002至pWH007、pWH009和pYA285至pYA292通过将pET-CAR系列质粒的载体替换为含有PλlacO1启动子、ColE1复制起点和氨苄青霉素抗性基因的载体来构建。质粒pJH131由2个片段制成：一个是去除yciA的质粒pML101，另一个是从质粒pEL181扩增的片段，含有scar序列（atcacgaggccctttcgtcttcacctcgag）、PλlacO1启动子、核糖体结合序列和来自L. brevis的pdup。类似地，质粒pYA267、pYA268、pYA271、pYA299和pYA300由2个片段连接而成：一个是yciA后平末端切割的质粒pML101，另一个是从质粒pWH4、pWH5、pYA292、pYA288和pYA290扩增的片段，分别含有scar序列、PλlacO1启动子、核糖体结合序列和来自S. rotundus、S. rugosus、N. iowensis、M. kyorinense和M. avium的CAR。为构建pML125、pYA311和pTC70，从pCS49扩增了含有PλlacO1启动子、pSC101复制起点和壮观霉素抗性基因的载体，另一片段为来自B. subtilis的sfp基因（经密码子优化并由Integrated DNA Technologies合成）、从S. rugosus gDNA扩增的entD或从实验室保藏中扩增的coaAR106A。此外，pYA312通过在来自S. rugosus的entD之后引入带有合成RBS序列（5′-AGGAGATATACC）的coaAR106A来构建。

【数据】质粒构建方法：Gibson DNA组装；扩增菌株：E. coli XL1-blue；CAR同源物来源：15种生物；scar序列：atcacgaggccctttcgtcttcacctcgag；合成RBS序列：5′-AGGAGATATACC；启动子：PT7、PλlacO1；抗性：壮观霉素、卡那霉素、氨苄青霉素

2.3 培养条件与培养基

所有大肠杆菌种子培养物在Luria肉汤（LB，购自FocusBio）中于37 °C、200 rpm旋转摇床培养。典型的ISPG生产实验使用M9培养基（12.8 g/L Na2HPO4·7H2O、3 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、0.5 g/L NH4Cl、1 mM MgSO4和0.1 mM CaCl2），补充0.1 g/L盐酸硫胺素、1 g/L酵母提取物和20 g/L葡萄糖。对于HMB的生物转化，在培养基中加入40 mM HMB（第3.3节）。在第3.5节中，向培养基中加入0.1 g/L D-泛酸半钙盐（维生素B5）以提供辅酶A。需要时，抗生素使用浓度为50 μg/mL卡那霉素（Kan）、100 μg/mL氨苄青霉素（Amp）和50 μg/mL壮观霉素（Spec）。细胞生长通过Biotek epoch 2微孔板分光光度计在600 nm波长（OD600）测量光密度。光密度路径长度校正通过将获得的值除以0.6（96孔板中200 μL液体的高度）来进行。

【数据】种子培养基：LB；种子培养温度：37°C；转速：200 rpm；M9培养基组分：12.8 g/L Na2HPO4·7H2O、3 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl、0.5 g/L NH4Cl、1 mM MgSO4、0.1 mM CaCl2；补充物：0.1 g/L盐酸硫胺素、1 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖；HMB浓度：40 mM；维生素B5浓度：0.1 g/L；Kan浓度：50 μg/mL；Amp浓度：100 μg/mL；Spec浓度：50 μg/mL；OD测量波长：600 nm

2.4 异戊二醇（ISPG）生产

种子培养物通过将单菌落分别接种到2 mL LB培养基中，在37 °C、200 rpm旋转摇床中过夜培养制备。然后将种子培养物以1%（V/V）接种到含有2 mL生产培养基的试管中，培养基如第2.3节所述。生长阶段和生产阶段均在37 °C、200 rpm旋转摇床中进行。当这些培养物的OD600达到0.4至0.6时，通过添加IPTG（异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷）至终浓度0.1 mM进行诱导以表达蛋白。诱导后，每24小时取样一次测量光密度。样品然后以18,000 x g离心5分钟，取上清液分析代谢物浓度。对于超过一天的发酵，使用2 N NaOH将培养物pH调节至7.0。

【数据】种子培养体积：2 mL LB；接种量：1%（V/V）；生产培养基体积：2 mL；诱导OD600：0.4-0.6；IPTG浓度：0.1 mM；取样间隔：每24 h；离心条件：18,000 x g、5 min；pH调节：2 N NaOH调至7.0；温度：37°C；转速：200 rpm

2.5 产物定量

培养物以18,000 × g离心2分钟以分离培养基和细胞。本研究中所有实验均使用上清液定量分泌的代谢物。所有代谢物通过配备光电二极管阵列检测器和示差折光检测器的Shimadzu LC-2030C高效液相色谱（HPLC）定量。使用Bio-Rad Aminex HPX-87H HPLC有机酸柱（300 × 7.8 mm，9 µm）在35 °C下分离代谢物。在分析柱前装备了Micro-Guard Cation H+保护柱（30 × 4.6 mm）。HPLC分析使用的流动相为5 mM H2SO4，流速0.6 mL/min。进样体积为20 μL。葡萄糖和ISPG浓度使用示差折光检测器监测，有机酸通过光电二极管阵列检测器在210 nm处监测。分析物浓度通过标准曲线确定。葡萄糖消耗通过原始葡萄糖浓度与培养基中测量值之间的差值确定。为确认生物合成ISPG的身份，对生产菌株上清液和商业标准品之间进行了气相色谱-质谱（GC–MS）分析（补充材料）。分析平台由Shimadzu GC–MS QP2020 NX系统组成，配备30米SH Rtx Wax毛细管柱，内径0.25 mm。氢气作为载气，恒定流速30.5 mL/min。进样器和检测器的温度均维持在250 °C。使用1:10的分流比将0.5 μL样品体积引入系统。柱温程序从40 °C开始持续2分钟，然后以每分钟10 °C的线性梯度升至250 °C，并在该温度下保持最终2分钟。质谱仪在扫描模式下运行，覆盖20至500 m/z的质量范围。

【数据】离心条件：18,000 × g、2 min；色谱柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H（300 × 7.8 mm，9 µm）；柱温：35°C；保护柱：Micro-Guard Cation H+（30 × 4.6 mm）；流动相：5 mM H2SO4；流速：0.6 mL/min；进样体积：20 μL；有机酸检测波长：210 nm；GC载气：氢气；载气流速：30.5 mL/min；进样器和检测器温度：250°C；进样体积：0.5 μL；分流比：1:10；柱温程序：40°C 2 min→10°C/min→250°C 2 min；质谱扫描范围：20-500 m/z

2.6 系统发育树分析和蛋白结合口袋分析

系统发育树分析使用最大似然法推断。

【数据】方法：最大似然法；原文未详述其他参数

研究结果

3.1 使用辅酶A酰化醛脱氢酶构建异戊二醇从头生物合成路径

为开发能够生产ISPG的大肠杆菌菌株，将HMB-CoA生物合成与负责将HMB-CoA还原为3-羟基-3-甲基丁醛的辅酶A酰化醛脱氢酶一起过表达，后者可利用内源性醇脱氢酶转化为ISPG（图1）。HMB-CoA生物合成使用质粒pRM9表达，该质粒携带乙酰辅酶A乙酰转移酶（atoB）、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶（mvaS）、3-甲基戊烯二酰辅酶A水合酶/3-甲基巴豆酰辅酶A水合酶（liuC）和3-甲基戊烯二酰辅酶A脱羧酶（aibAB）的基因。质粒pCDF-bldh用于表达辅酶A酰化醛脱氢酶Bldh。此处选择来自Clostridium saccharoperbutylacetonicum的Bldh，因其对丁酰辅酶A、3-羟基丁酰辅酶A和异丁酰辅酶A均表现出活性，这些底物均与HMB-CoA相似。如图2A所示，携带质粒pRM9和pCDF-Bldh的大肠杆菌菌株BL21 (DE3)在2天内产生了55 mg/L ISPG，表明该路径的功能性构建成功。然而，与之前展示的HMB滴度相比，该ISPG滴度显著较低。我们推测这一结果可能是由于Bldh的氧敏感性或其对HMB-CoA的低催化效率。因此，研究合适的辅酶A酰化醛脱氢酶对于提高ISPG产量至关重要。

【数据】菌株：E. coli BL21 (DE3)；质粒：pRM9和pCDF-Bldh；ISPG产量：55 mg/L；时间：2天；路径基因：atoB、mvaS、liuC、aibAB；醛脱氢酶：Bldh（来自C. saccharoperbutylacetonicum）

3.2 挖掘耐氧辅酶A酰化醛脱氢酶以提高ISPG滴度

接下来，我们用耐氧的辅酶A酰化丙醛脱氢酶PduP替换了C. saccharoperbutylacetonicum Bldh，PduP此前已被证明可用于丁酰辅酶A还原并用于好氧正丁醇生物合成。选择了来自8种不同生物的PduP同源物，包括Salmonella enterica、Aeromonas hydrophila、Klebsiella pneumoniae、Lactobacillus brevis、Lactobacillus reuteri、Listeria monocytogenes、Citrobacter koseri和Porphyromonas gingivalis，评估其还原HMB-CoA的能力。如图2B所示，表达来自L. brevis和L. reuteri的PduP与HMB-CoA生物合成的菌株产生了更高水平的ISPG，分别在24小时内达到135.5 mg/L和73.6 mg/L。值得注意的是，不同PduP表达菌株的总摩尔产物池（HMB和ISPG）差异显著。这种差异不是由于细胞生长差异造成的（补充材料）。先前的研究表明，PduP同源物对各种链长的酰基辅酶A（包括乙酰辅酶A）具有广泛的底物混杂性。产生较低HMB和ISPG总量的菌株相应地产生了更高水平的乙醇（补充材料）。这一结果表明PduP对乙酰辅酶A的活性是ISPG生物合成的主要竞争途径。随后，我们将表现最佳的来自L. brevis的pduP与HMB-CoA生物合成操纵子组合到单个质粒pJH131中（图2C）。携带pJH131的菌株BL21 (DE3)在24小时内产生了400 mg/L ISPG（图2D）。同时，在培养基中还观察到230 mg/L的3-羟基-3-甲基丁酸（HMB），表明胞内HMB-CoA被内源性硫酯酶水解，这是与ISPG生物合成的竞争反应。如先前研究所示，大肠杆菌中的内源性硫酯酶对HMB-CoA表现出水解活性。其中，YciA、TesB和MenI显示出最高的水解活性。这些硫酯酶对辅酶A中间体也表现出不同的底物偏好。例如，YciA是一种相对非特异性的硫酯酶，也能水解HMG-CoA、3MC-CoA和3MG-CoA，导致副产物积累。因此，为了消除HMB分泌并将HMB-CoA通量集中于ISPG生物合成，在ISPG生产菌株中敲除了yciA、tesB和menI。如图2D所示，通过去除这些内源性硫酯酶实现了更低的HMB产量。然而，ISPG产量并未增加。这一结果表明ISPG生物合成中的潜在限速步骤是PduP催化的还原。我们注意到PduP是一种NADH依赖性酶。先前的生物生产研究表明，NADH依赖性途径通常需要厌氧或微需氧条件才能达到更高滴度。然而，当使用葡萄糖作为底物时，该ISPG生产途径是氧化还原过量的，因为化学计量上1.5分子葡萄糖转化为1分子ISPG产生1分子NADH。这种行为需要好氧条件来适当回收NADH。通常，好氧条件下NADH/NAD+比率为0.03。鉴于辅酶A酰化醛脱氢酶的ΔrG'°为+10.5 kJ/mol（以丁酰辅酶A作为替代底物），HMB-CoA的还原可能在热力学上不利，从而限制了下游ISPG的产生。为进一步解决这种硫酯酶介导的瓶颈，可以探索替代缓解策略，如靶向酶突变以改变底物结合口袋特异性，或用较弱的调控元件替换天然启动子以下调其表达。

【数据】PduP同源物来源：8种生物；L. brevis PduP菌株ISPG产量：135.5 mg/L（24 h）；L. reuteri PduP菌株ISPG产量：73.6 mg/L（24 h）；pJH131菌株ISPG产量：400 mg/L（24 h）；HMB产量：230 mg/L；敲除基因：yciA、tesB、menI；NADH/NAD+比率：0.03（好氧条件）；ΔrG'°：+10.5 kJ/mol

3.3 挖掘作用于HMB的羧酸还原酶

由于使用该路径从葡萄糖生产HMB可以在24小时内达到相对较高的5.2 g/L滴度，我们接下来评估使用羧酸还原酶（CAR）将HMB直接还原为3-羟基-3-甲基丁醛。CAR催化ATP和NADPH依赖性的羧酸还原为相应的醛。它广泛用于芳香醛的生产。由于好氧条件下生长的大肠杆菌细胞的典型胞内ATP/AMP和NADPH/NADP+比率大于1，使用CAR将HMB转化为3-羟基-3-甲基丁醛可能比辅酶A酰化醛脱氢酶途径在热力学上更有利。考虑到来自Nocardia iowensis的CAR是第一个被发现的CAR，并已成功在大肠杆菌中表达，我们因此将其与HMB生物合成一起异源表达。如图4所示，携带质粒pYA271的菌株BL21 (DE3)从葡萄糖产生了150 mg/L ISPG，同时610 mg/L HMB作为副产物残留。溶液中残留的较高HMB量表明N. iowensis CAR可能不适合HMB还原，可能是该途径的限速步骤。此前，来自Mycobacterium abscessus的CAR已被用于将3-羟基丁酸转化为3-羟基丁醛，用于生产1,3-丁二醇的研究。因此，以其作为序列模板，使用BLAST通过序列比对鉴定了13个额外的CAR同源物。这些CAR同源物随后被克隆并测试其将HMB转化为3-羟基-3-甲基丁醛的能力。总共15株大肠杆菌菌株，每株表达一个CAR同源物（包括来自N. iowensis和M. abscessus的），在补充了HMB的培养基中培养。图3A显示了这些菌株将HMB生物转化为ISPG的结果。为评估这些CAR同源物的功能，将40 mM HMB添加到表达每个CAR同源物的菌株培养基中。在测试的不同CAR同源物中，至少10个对ISPG生产具有活性，因为这些CAR表达菌株的培养基中观察到了ISPG。ISPG产量在0.36至2.2 g/L之间变化，相当于3.46至21.2 mM。

【数据】HMB滴度：5.2 g/L（24 h）；pYA271菌株ISPG产量：150 mg/L；HMB残留：610 mg/L；CAR同源物数量：15个；HMB添加浓度：40 mM；ISPG产量范围：0.36-2.2 g/L（3.46-21.2 mM）；活性CAR数量：至少10个

3.4 使用CAR进行异戊二醇从头生物合成

选定的CAR，包括来自N. iowensis、S. rotundus、S. rugosus、M. kyorinense和M. avium的CAR，与HMB生物合成途径组合以构建相应的质粒：pYA271、pYA267、pYA268、pYA299和pYA300。携带这些质粒的BL21(DE3)菌株在M9培养基中培养，补充2%葡萄糖和40 mM HMB。

【数据】质粒：pYA271、pYA267、pYA268、pYA299、pYA300；菌株：BL21(DE3)；培养基：M9；葡萄糖：2%；HMB：40 mM

3.5 增加辅酶A供应实现更高ISPG产量

携带ISPG生物合成途径（pYA268）的大肠杆菌BL21(DE3)分别与单独表达EntD（pYA311）、同时表达EntD和CoaAR106A（pYA312）以及添加0.1 g/L维生素B5组合，评估ISPG产量。结果如图5A所示。对HMB的共转化进行了评估（图5B）。

【数据】菌株：E. coli BL21(DE3)；质粒：pYA268；组合：pYA311（EntD）、pYA312（EntD+CoaAR106A）、维生素B5 0.1 g/L；维生素B5浓度：0.1 g/L

3.6 最终菌株的ISPG产量

通过后续的酶挖掘和增加胞内辅酶A可用性，最终菌株从葡萄糖生产ISPG的滴度达到2.2 g/L，得率为0.11 g ISPG/g葡萄糖。

【数据】ISPG滴度：2.2 g/L；得率：0.11 g ISPG/g葡萄糖

讨论与解读

本研究通过两条不同策略实现了从葡萄糖生产异戊二醇。第一条路线将辅酶A酰化醛脱氢酶与HMB-CoA生物合成偶联；第二条路线将羧酸还原酶（CAR）途径与HMB生物合成配对。酶挖掘进一步提升了路径性能，来自L. brevis的PduP和来自S. rugosus的CAR产生了显著更高的ISPG滴度。增强胞内辅酶A可用性提供了额外的提升，使基于CAR的工程菌株达到2.2 g/L的滴度和0.11 g/g的得率。考虑到主要制造商生产的ISPG市场价值约为每公斤10-20美元，而葡萄糖价格约为每公斤0.60美元，本工作实现的0.11 g/g转化得率为石化ISPG生产提供了一种有前景且具有潜在竞争力的绿色替代方案。然而，当前的经济评估是初步的，因为它依赖于补充维生素B5以增强辅酶A可用性的培养基。尽管需要在更大规模生物反应器中进行进一步验证以实现工业转化，但这些初步的规模比较为未来的生物过程开发提供了坚实的基础。未来工作将集中于优化细胞代谢以消除或减少对外部维生素B5补充的依赖，从而提供更严格且更具成本效益的生产方案。

编译者解读：该研究展示了合成生物学在化妆品原料绿色制造中的应用潜力。方法上，作者通过系统的酶挖掘策略——从辅酶A酰化醛脱氢酶到羧酸还原酶——逐步解决了路径中的限速步骤，这种"生物勘探"思路值得借鉴。2.2 g/L的滴度虽然距离工业需求仍有差距，但0.11 g/g的碳得率已展现出经济可行性。主要局限在于依赖维生素B5补充和好氧条件下的氧化还原平衡问题，未来可通过代谢工程改造辅酶A再生途径或优化NADPH供应来突破。该工作为其他非天然醇类化合物的生物合成提供了可参考的路径设计范式。

参考来源

期刊：Bioresource Technology, 2026

DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135539

DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135539