来源：Luteinizing hormone regulates testosterone biosynthesis via the cAMP/PKA-CREB pathway in Leydig cells of Tibetan sheep（The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular ）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
藏羊是青藏高原特有畜种，其繁殖效率偏低制约了种群扩繁与遗传改良。睾酮合成不足会直接削弱公羊精液品质与繁殖性能，而促黄体生成素（LH）是调控间质细胞（LCs）睾酮合成的关键促性腺激素。本研究从藏羊睾丸中分离纯化原代LCs，系统考察了LH处理不同时间后睾酮分泌、类固醇合成酶表达、细胞增殖与凋亡的变化，并验证了cAMP/PKA-CREB通路的参与。结果显示150 ng/mL LH处理24 h时睾酮合成达到峰值，LH通过激活cAMP/PKA-CREB级联促进睾酮生成、推动增殖并抑制凋亡。
研究背景
藏羊是我国三大地方绵羊品种之一，分布于高海拔地区，肉质细嫩、风味温和，是优质高原羊肉品种，对提高当地农牧民经济收入具有重要作用。与商业化肉羊品种相比，藏羊性成熟较晚，且依赖群体内种内繁殖。此外，羊群中种公羊数量极为有限，导致繁殖效率低下，制约了该品种的遗传改良和大规模稳定生产。因此，改善藏羊公羊的繁殖性能尤为重要。
睾酮（T）是雄性体内主要的雄激素，对繁殖、肌肉发育、骨稳态、能量代谢等生理过程发挥多效性调控作用。睾酮合成不足会导致生育力下降、精液品质恶化、性欲减退、骨质疏松及年龄相关代谢紊乱。在畜牧生产中，睾酮合成直接决定睾丸发育、精子发生和繁殖性能。缺乏睾酮刺激时，精子发生无法通过减数分裂阶段，进而损害繁殖效率与经济效益。
LH作为关键促性腺激素，调控LCs的生理功能与睾丸睾酮合成，在雄性动物繁殖能力和性腺功能调节中不可或缺。然而，LH调控藏羊LCs类固醇激素合成的分子机制尚不清楚。本研究分离培养藏羊原代LCs，以LH处理不同时长，检测睾酮分泌、关键类固醇合成酶表达、细胞增殖与凋亡，以及cAMP/PKA信号通路相关分子水平，以期阐明LH调控藏羊LCs睾酮合成的分子机制。
研究方法
2.1 实验样品采集
本研究从52只体重相近的健康一岁龄雄性藏羊中采集睾丸组织。所有实验动物均来自青海省湟源屠宰场（东经101.25°，北纬36.67°，海拔3300 m）。所有个体在屠宰前均采用统一的传统放牧方式饲养，自由采食天然牧草和饮水，整个饲养期未补充精饲料。样品经无菌处理后，在低温条件下运回实验室。本研究所有动物实验程序均经甘肃农业大学动物伦理委员会审查批准（伦理批准号：GSAU-Eth-vwc−2022–009，批准日期：2022年3月10日）。
【数据】动物数量：52只；年龄：1岁；体重：相近；海拔：3300 m；经纬度：E 101.25°, N 36.67°；伦理批准号：GSAU-Eth-vwc−2022–009；批准日期：2022年3月10日
2.2 睾丸LCs的分离与培养
在实验室中，使用无菌手术剪剥离附睾、筋膜和脂肪组织。向睾丸动脉注入生理盐水冲洗组织，以减少红细胞污染。将睾丸组织置于无菌培养皿中，用无菌镊子分离，然后转移至含有0.1% I型胶原酶（Gibco，美国）和0.03%透明质酸酶（Gibco，美国）的无菌烧杯中。在37℃水浴摇床中消化30 min。终止消化后，以1500 r/min离心10 min。细胞用PBS（Gibco，美国）重悬并洗涤三次。将细胞悬液加入密度分别为1.090 g/mL、1.080 g/mL、1.065 g/mL和1.045 g/mL的Percoll梯度分离液（Solarbio，北京，中国）中，随后在4℃下以1000 ×g离心30 min。收集1.080 g/mL的Percoll层，以1500 r/min离心10 min。细胞用PBS重悬并洗涤三次。细胞悬液在含10% FBS（民海生物，兰州，中国）的DMEM/F12（Gibco，美国）中培养，置于37℃、5% CO₂细胞培养箱（Thermo，美国）中。
【数据】胶原酶I浓度：0.1%；透明质酸酶浓度：0.03%；消化温度：37℃；消化时间：30 min；离心转速：1500 r/min；离心时间：10 min；Percoll密度：1.090、1.080、1.065、1.045 g/mL；超速离心：1000 ×g，30 min，4℃；培养基：DMEM/F12 + 10% FBS；培养条件：37℃、5% CO₂
2.2.1 Percoll梯度溶液的配制
将未稀释的Percoll与0.85% NaCl按9:1体积比混合，制备100% Percoll储备液，然后用0.85% NaCl稀释以生成密度梯度溶液。所有15 mL玻璃离心管均用胎牛血清预冲洗。使用注射器从高密度到低密度缓慢叠加梯度层，制备好的梯度保存于4℃。每种密度梯度溶液总体积设为10 mL：1.090 g/mL梯度含7.2 mL 100% Percoll储备液和2.8 mL 0.85% NaCl；1.080 g/mL梯度含6.4 mL 100% Percoll储备液和3.6 mL 0.85% NaCl；1.065 g/mL梯度含5.1 mL 100% Percoll储备液和4.9 mL 0.85% NaCl；1.045 g/mL梯度含3.4 mL 100% Percoll储备液和6.6 mL 0.85% NaCl。
【数据】Percoll储备液配比：Percoll:0.85% NaCl = 9:1；各梯度总体积：10 mL；1.090 g/mL：7.2 mL储备液+2.8 mL NaCl；1.080 g/mL：6.4 mL储备液+3.6 mL NaCl；1.065 g/mL：5.1 mL储备液+4.9 mL NaCl；1.045 g/mL：3.4 mL储备液+6.6 mL NaCl；保存温度：4℃
2.3 睾丸LCs的鉴定
3β-HSD染色：3β-HSD是类固醇激素合成中的关键限速酶，其活性检测可用于LCs的鉴定。吸取约10 μL细胞悬液，均匀滴加于载玻片上，自然风干。随后，细胞与新鲜配制的染色液（Solarbio，北京，中国）孵育2 h。蒸馏水冲洗后，在显微镜下观察并采集保存图像。
【数据】细胞悬液用量：约10 μL；染色液孵育时间：2 h；染色液来源：Solarbio，北京，中国
2.3.1 3β-HSD染色液的配制
溶液A：10 mg/mL NAD溶于PBS。溶液B：10 mg/mL NBT和0.5 mg DHEA溶于DMSO。溶液C：1 mg/mL NAM溶于PBS。新鲜工作液由100 μL A液、10 μL B液、100 μL C液和790 μL PBS混合而成。将10 μL细胞悬液均匀涂布于载玻片上并充分风干。
【数据】溶液A：10 mg/mL NAD in PBS；溶液B：10 mg/mL NBT + 0.5 mg DHEA in DMSO；溶液C：1 mg/mL NAM in PBS；工作液配比：100 μL A + 10 μL B + 100 μL C + 790 μL PBS；细胞悬液用量：10 μL
油红O染色（Solarbio，北京，中国）。细胞内脂滴含量可在一定程度上反映游离胆固醇水平，进而间接指示LCs的睾酮合成能力。因此，油红O染色可用于评估LCs的纯度。
【数据】染色试剂来源：Solarbio，北京，中国
2.3.2 油红O染色
去除培养基后，细胞用PBS洗涤两次，在油红O固定液中固定30 min。经两次蒸馏水冲洗后，样品用60%异丙醇处理30 s。去除异丙醇后，细胞用油红O工作液染色20 min。弃去染液，细胞在60%异丙醇中分化30 s，用蒸馏水冲洗三次。Mayer苏木精复染2 min。样品洗涤三次，在油红O缓冲液中平衡1 min，覆盖蒸馏水后在显微镜下观察。
【数据】固定时间：30 min；60%异丙醇处理：30 s；油红O染色时间：20 min；分化时间：30 s；苏木精复染时间：2 min；缓冲液平衡时间：1 min
2.4 睾丸LCs的生长特性
将第二传代LCs以每孔1 × 10⁵个细胞的密度接种于96孔板中，连续培养9天。在此期间，每天使用酶标仪（GE，美国）通过CCK−8法（Solarbio，北京，中国）在450 nm处测定细胞活力。根据结果绘制LCs的标准曲线和生长曲线，以阐明原代培养LCs的生长特性。
【数据】细胞接种密度：1 × 10⁵ cells/孔；培养时间：9天；检测波长：450 nm；检测方法：CCK−8；酶标仪：GE，美国
2.5 CCK法检测细胞活力
使用对数生长期的第二传代LCs。当细胞融合度达到约80%时，用不同浓度的LH（Sigma-Aldrich，美国）处理不同时长。随后使用酶标仪在450 nm处测定各组的OD值。通过计算确定细胞活力的最佳LH浓度，为后续实验提供依据。
【数据】细胞融合度：约80%；检测波长：450 nm；LH来源：Sigma-Aldrich，美国
2.6 细胞上清液中睾酮的测定
对数生长期的第二代LCs用LH处理后，收集细胞培养上清液。使用绵羊睾酮ELISA试剂盒（MLBio，上海，中国）测定睾酮浓度，使用cAMP检测试剂盒（Solarbio，北京，中国）测定cAMP水平。
【数据】睾酮检测试剂盒：绵羊睾酮ELISA（MLBio，上海，中国）；cAMP检测试剂盒：Solarbio，北京，中国
2.7 实时荧光定量PCR检测
对数生长期的第二传代LCs用LH处理不同时长。收集各处理组细胞，使用TransZol试剂（TransGen Biotech，北京，中国）提取总RNA，随后进行反转录。以各组cDNA为模板，β-actin为内参基因，在实时荧光定量PCR系统（Roche，瑞士）上进行扩增。RT-qPCR循环条件：95℃初始变性300 s，随后45个循环的95℃ 5 s、58℃ 30 s、72℃ 15 s。我们已在表1中更新了所有引物退火温度以及新合成引物的序列。相对基因表达水平采用2⁻ΔΔCt法计算。
【数据】RNA提取试剂：TransZol；内参基因：β-actin；初始变性：95℃，300 s；循环数：45；变性：95℃，5 s；退火：58℃，30 s；延伸：72℃，15 s；定量方法：2⁻ΔΔCt法；PCR系统：Roche，瑞士
2.8 Western blot分析
对数生长期的第二传代LCs用LH处理，分别收集不同时间点的细胞。使用RIPA裂解液（Solarbio，北京，中国）提取总蛋白，使用BCA蛋白检测试剂盒（Solarbio，北京，中国）测定蛋白浓度。将提取的蛋白与4 × 蛋白上样缓冲液（Solarbio，北京，中国）按3:1（样品:缓冲液）比例混合，在100℃金属浴中变性10 min。使用Solarbio（北京，中国）试剂盒制备12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离胶。将等体积变性蛋白样品上样至凝胶进行电泳。电泳条件为70 V 30 min，然后110 V 60 min。电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜（Merck，德国），转膜条件为110 V 60 min。用PBST缓冲液洗涤三次。随后用5%脱脂奶粉封闭3 h，再用PBST洗涤三次。加入一抗……
【数据】蛋白裂解液：RIPA；蛋白定量：BCA法；蛋白与上样缓冲液比例：3:1；变性温度：100℃；变性时间：10 min；分离胶浓度：12%；电泳条件：70 V 30 min → 110 V 60 min；转膜电压：110 V；转膜时间：60 min；封闭液：5%脱脂奶粉；封闭时间：3 h；膜材料：PVDF（Merck，德国）
研究结果
3.1 藏羊睾丸LCs的培养与鉴定
通过Percoll密度梯度离心从藏羊睾丸中分离纯化原代LCs，随后进行体外培养。结果显示，培养12 h后细胞状态趋于稳定，细胞正常贴壁于培养基底。培养24 h后，细胞逐渐伸展，呈现典型的不规则纺锤形形态。培养48 h时细胞融合度约达50%，72 h时增至100%，形成紧密的单层（图1A）。生长曲线分析显示，藏羊原代LCs呈现典型的S形生长模式。细胞在培养第2天进入对数生长期，增殖活性旺盛，而在培养第7天达到平台期后细胞增殖明显减缓并趋于稳定（图1B）。HSD3B1特异性染色结果显示，经Percoll密度梯度离心分离的LCs呈阳性染色，呈现深浅不一的蓝紫色（图1C）。油红O染色证实LCs胞质内分布大量半透明橙色脂滴，呈阳性染色（图1D）。免疫荧光染色进一步验证，体外培养的原代LCs呈现不规则纺锤形形态，HSD3B1蛋白在细胞质和细胞核中均有表达（图1E）。多种特异性染色实验的综合数据证实，本研究分离培养的藏羊原代LCs具有高纯度和良好的细胞状态，满足后续实验研究的要求。
【数据】细胞状态稳定时间：12 h；细胞融合度：48 h约50%，72 h达100%；对数生长期：第2天；平台期：第7天；HSD3B1染色：阳性；油红O染色：阳性；免疫荧光：HSD3B1在胞质和胞核表达
3.2 藏羊睾丸LCs的睾酮合成能力
采用CCK−8法检测不同浓度LH及不同处理时长对LCs活力的影响。结果显示，150 ng/mL LH处理组在LH刺激12 h后细胞活力达到峰值，该组细胞活力与所有其他处理组相比差异极显著（P < 0.01，图2A）。通过ELISA建立了藏羊睾酮合成检测的标准曲线。标准曲线的决定系数（R²）大于0.99（图2B），表明本研究采用的睾酮检测方法具有优良的线性拟合效果，所测数据真实可靠。用梯度浓度LH处理LCs，测定细胞培养上清液中的睾酮含量（图2C）。结合细胞活力和睾酮合成结果，确定150 ng/mL为LCs处理的最佳LH浓度，并应用于所有后续实验。测定未处理空白对照LCs培养上清液中的睾酮水平。结果显示，在所有检测的培养时间点均可检测到睾酮，且不同培养时长间睾酮含量存在显著差异（图2D）。用最佳LH浓度150 ng/mL分别处理LCs 0 h、6 h、12 h、24 h、36 h和48 h。收集各组培养上清液测定睾酮浓度。所有LH处理组均可检测到睾酮（图2E），且睾酮浓度随LH处理时间延长总体呈先升后降趋势，各组间差异极显著（P < 0.01）。我们推测这种变化模式可能与培养后期细胞密度过大诱导细胞凋亡等生理过程密切相关。同时，所有LH处理组的睾酮浓度均显著高于未处理空白对照组。各组具有一致的睾酮分泌动态趋势（先升后降），LH刺激24 h后睾酮合成达到最大值。
【数据】最佳LH浓度：150 ng/mL；最佳细胞活力时间点：12 h；细胞活力差异：P < 0.01；睾酮标准曲线R²：>0.99；LH处理时间点：0、6、12、24、36、48 h；睾酮峰值时间：24 h；组间差异：P < 0.01
3.3 LH处理不同时间点对睾丸LCs的影响
为进一步探究150 ng/mL LH对LCs的调控作用，检测了该浓度LH处理不同时长后LCs中睾酮合成相关基因的mRNA表达水平（图3A–F）。结果表明，睾酮合成相关基因的mRNA表达水平随LH处理时间延长总体呈先上调后下调趋势。其中，CYP11A1、CYP19A1和HSD17B1的mRNA丰度在LH刺激12 h后达到峰值，显著高于其他所有时间点，组间差异极显著（P < 0.01）。相比之下，CYP17A1、STAR和HSD3B1的mRNA表达水平在LH处理24 h时达到最大值，各时间点间差异极显著（P < 0.01）。基于上述睾酮合成相关基因的表达结果，进一步检测了细胞增殖相关基因的mRNA水平（图3G–H），以阐明LH处理时长对LCs增殖的影响。结果显示，LCs增殖率随LH处理时间延长逐渐降低。LH刺激48 h后细胞增殖水平极显著低于0 h对照组（P < 0.01）。此外，凋亡相关基因检测结果（图3I–J）显示，LCs中促凋亡因子BAX的mRNA水平与LH处理时长呈正相关，在LH刺激36 h后表达最高，组间差异极显著（P < 0.01）。相反，抗凋亡因子BCL−2的mRNA表达随LH处理时间延长持续下降，与干预时长呈负相关。
【数据】CYP11A1、CYP19A1、HSD17B1 mRNA峰值时间：12 h；CYP17A1、STAR、HSD3B1 mRNA峰值时间：24 h；组间差异：P < 0.01；增殖率48 h vs 0 h：P < 0.01；BAX mRNA峰值时间：36 h；组间差异：P < 0.01；BCL−2：随处理时间持续下降
3.4 LH处理不同时间点对睾丸LCs的影响
为进一步探究150 ng/mL LH对LCs的调控作用，在LH刺激不同时长后测定了睾酮生物合成酶的蛋白丰度（图4A–H）。结果显示，大多数类固醇合成蛋白水平随LH孵育时间延长呈先升高后降低趋势。其中，CYP11A1、CYP19A1和HSD17B1的蛋白丰度在LH处理后24 h达到峰值，极显著高于其他所有时间点（P < 0.05）。相比之下，CYP17A1和HSD3B1的蛋白最大表达出现在LH刺激12 h时，各采样时间点间差异极显著（P < 0.05）。值得注意的是，STAR蛋白丰度与LH处理时长呈正相关，未呈现典型的先升后降表达模式。除STAR外，其他类固醇合成蛋白的时间表达趋势与其对应基因的mRNA谱基本一致。此外，这些蛋白水平的动态变化与ELISA测定的培养上清液睾酮浓度曲线相匹配，进一步验证了本实验数据的真实性和可靠性。
为研究LH处理对靶LCs增殖和凋亡的调控作用，首先采用Western blot检测一系列时间梯度（0、6、12、24、36和48 h）下增殖相关蛋白（CCND1、PCNA）和凋亡相关蛋白（BAX、BCL−2）的表达动态。定量灰度分析显示，与0 h对照组相比，CCND1和PCNA的蛋白丰度在6 h至24 h显著上调（P < 0.05），在24 h达到最大表达。其蛋白水……
【数据】CYP11A1、CYP19A1、HSD17B1蛋白峰值时间：24 h，P < 0.05；CYP17A1、HSD3B1蛋白峰值时间：12 h，P < 0.05；STAR：与处理时长正相关；CCND1、PCNA上调时间：6–24 h，P < 0.05，峰值24 h
3.5 LH对LCs增殖、凋亡和细胞周期的影响
Western blot检测LH处理后0、6、12、24、36、48 h的CCND1、PCNA、BAX和BCL−2蛋白表达（图5A、D），以β-actin作为上样对照。定量分析显示，CCND1和PCNA蛋白丰度在6–24 h显著上调（P < 0.05），24 h达到峰值（图5B、C）。BAX蛋白表达随LH处理时间延长逐渐升高，36 h达到最高（图5E）。BCL−2蛋白表达随处理时间延长持续下降（图5F）。不同小写字母表示组间显著差异。
【数据】CCND1、PCNA蛋白上调：6–24 h，P < 0.05，峰值24 h；BAX蛋白峰值：36 h；BCL−2蛋白：持续下降；内参：β-actin
3.6 150 ng/mL LH处理24 h对LCs的影响
免疫荧光分析检测了150 ng/mL LH处理24 h后LCs中CYP11A1（图6A）、CYP19A1（图6B）、HSD3B1（图6C）、PCNA（图6D）以及BAX和BCL−2（图6E）的表达。右侧柱状图为表达定量分析。
【数据】LH浓度：150 ng/mL；处理时间：24 h；检测蛋白：CYP11A1、CYP19A1、HSD3B1、PCNA、BAX、BCL−2；方法：免疫荧光
3.7 抑制PKA逆转LH诱导的睾酮合成及cAMP/PKA/CREB信号通路激活
通过ELISA检测对照组、LH处理组、H−89处理组和LH + H−89共处理组中LCs的睾酮分泌水平（图7A）。cAMP检测标准曲线（图7B）用于定量cAMP水平。结果显示，LH处理显著提高睾酮分泌和cAMP水平，而PKA抑制剂H−89可逆转LH诱导的睾酮合成增加及cAMP/PKA/CREB信号通路的激活。
【数据】分组：Control、LH、H−89、LH + H−89；检测指标：睾酮、cAMP；PKA抑制剂：H−89；方法：ELISA
3.8 LH调控LCs中睾酮生物合成
图8总结了LH通过cAMP/PKA-CREB通路调控藏羊LCs睾酮生物合成的分子机制模型。
【数据】通路：cAMP/PKA-CREB；调控目标：睾酮生物合成；细胞类型：藏羊LCs
讨论与解读
睾酮是调控雄性动物生殖发育、精子发生和生殖功能稳态的核心类固醇激素。全身睾酮水平下降会直接损害精子质量，进而引发雄性生殖功能障碍。因此，睾酮合成的动态平衡对维持生理稳态、保障动物繁殖性能和生殖健康至关重要。睾酮可上调成年哺乳动物支持细胞中血-睾屏障组装和功能维持相关基因的表达，从而建立局部免疫抑制的睾丸微环境，为生殖细胞减数分裂和精子细胞正常发育提供适宜条件。LCs是雄性生物体中负责睾酮合成与分泌的主要功能细胞。本研究分离制备了原代LCs，并通过Percoll密度梯度离心进行纯化。形态学观察表明，纯化后的细胞呈纺锤形或不规则多边形。此外，体外培养系统能够稳定产生睾酮。所分离细胞的形态学和睾酮合成功能特征与Wu等报道的结果一致。LCs的核心生理功能是响应LH信号……
编译者解读
本研究以藏羊原代LCs为模型，将LH剂量-时间-效应关系与cAMP/PKA-CREB通路验证相结合，为高原家畜繁殖调控提供了较为完整的分子证据链。方法上，Percoll密度梯度离心联合3β-HSD/油红O双重鉴定保证了细胞纯度，150 ng/mL LH、24 h的窗口界定清晰可重复。局限在于研究停留于体外细胞水平，未涉及体内激素反馈与血-睾屏障互作，STAR蛋白不降反升的机制也未展开。对合成生物学而言，CYP11A1/CYP17A1/HSD3B1等限速酶的表达时序数据可作为构建异源睾酮合成模块的调控元件参考。
参考来源
期刊：The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2026
DOI: 10.1016/j.jsbmb.2026.107094
DOI: 10.1016/j.jsbmb.2026.107094