来源：Bioorthogonal chemistry-driven multi-enzyme strategy for efficient terpenoid biosynthesis（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
萜类化合物是结构多样的天然产物，在医药和工业领域应用广泛。传统体内合成路线受限于胞内环境复杂性和代谢通量不足。本研究开发了一种体外多酶级联策略，利用生物正交蛋白配对技术将缩短的甲羟戊酸（MVA）通路中的六个酶组装为有序交联酶复合物（O-CLEs），实现可控的空间组织。多层荧光标记技术（MLFLT）证实了酶在O-CLEs中的有序排列。以β-法尼烯为模型产物，组装后的O-CLEs产量达49.08 ± 1.91 mg/L，较野生型游离酶混合物提高1.39倍，较随机交联酶复合物（R-CLEs）提高3.03倍，六次循环使用后仍保留62 ± 9%的初始活性。将β-法尼烯合酶替换为紫杉二烯合酶后，该策略可拓展至紫杉二烯合成，展现出模块化设计和通用性。
研究背景
萜类化合物由异戊二烯单元生物合成而来，是植物来源代谢物中最大的一类，具有抗癌、抗菌和神经保护等多种生物活性。紫杉二烯是抗癌药物紫杉醇的关键前体，β-法尼烯则是维生素E合成的可再生底物和优质香料成分。传统的植物提取和微生物发酵策略受限于产物含量低、产量有限和生产周期长等问题——植物提取受季节性和低产率制约，微生物发酵则面临乙酰辅酶A前体竞争和毒性中间体积累等瓶颈。为应对这些挑战，研究者已开发了包含两个和三个功能模块的多变量模块化策略来改造代谢通路。在此背景下，本研究提出了一种基于生物正交化学的体外多酶有序组装策略，通过精确控制酶的空间排列来增强底物通道效应，为高价值萜类化合物的可持续体外生产提供平台。
研究方法
2.1 质粒与菌株构建
大肠杆菌（E. coli）DH5α和BL21(DE3)菌株购自Novagen。pET-28a(+)质粒购自Invitrogen公司（美国）。所有异源基因在合成前均根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化，所有引物由Generay Biotech（上海，中国）合成。所有质粒和引物列于补充材料中。PrimeStar Max Premix、T4 DNA连接酶、蛋白marker、碱性磷酸酶（小牛肠来源，CIAP）和限制性内切酶均购自Takara Biomedical Technology（北京）有限公司。质粒构建和目标基因突变通过基因测序验证（Tsingke Biotechnology，中国）。
【数据】菌株：E. coli DH5α、BL21(DE3)；质粒：pET-28a(+)；抗生素：卡那霉素50 µg/mL或氯霉素34 µg/mL；试剂来源：Takara、Invitrogen、Generay；测序公司：Tsingke Biotechnology
2.2 蛋白表达与分析
携带表达质粒的大肠杆菌细胞在Luria-Bertani（LB）培养基中于37°C培养，加入适当抗生素（如卡那霉素50 µg/mL或氯霉素34 µg/mL）。对于蛋白表达，细胞在100 mL LB培养基中于37°C、220 rpm振荡培养至OD600达到0.6–0.8，随后诱导蛋白表达并在18°C继续培养16–18 h。通过离心收集细胞（8,000 rpm，5 min，4°C）。细胞沉淀重悬于10倍体积（w/v）的磷酸盐缓冲液（50 mM PBS，pH 7.5）中，匀浆获得均匀悬浮液。冰上超声破碎细胞（5 s脉冲，7 s间隔，总计20 min）。裂解液通过离心澄清（10,000 rpm，15 min，4°C）去除细胞碎片。所得上清液使用Ni2+-NTA亲和柱（Cytiva，美国）纯化以捕获His标签蛋白。洗涤后，用含250–500 mM咪唑的缓冲液洗脱His标签蛋白。洗脱的蛋白通过超滤装置（Merck Millipore Amicon Ultra-15，10 kDa/5 kDa分子量，MA，美国）浓缩并置换至储存缓冲液（50 mM PBS，pH 7.5）中，主要目的是去除咪唑并在后续实验前将蛋白置换至储存缓冲液。蛋白样品（裂解上清液、不溶性组分和纯化蛋白）通过SDS-PAGE分析。
【数据】培养基：LB；培养温度：37°C（表达诱导后18°C）；振荡转速：220 rpm；诱导OD600：0.6–0.8；表达时间：16–18 h；离心条件：8,000 rpm，5 min，4°C；超声条件：5 s脉冲/7 s间隔/20 min；裂解液离心：10,000 rpm，15 min，4°C；PBS浓度：50 mM，pH 7.5；咪唑洗脱浓度：250–500 mM；超滤膜分子量截止：10 kDa/5 kDa
2.3 酶交联
通过浓缩全细胞裂解物上清液获得六种重组酶的粗制样品。使用Bradford法测定每种粗酶溶液的蛋白浓度，并根据其理论分子量计算每种重组酶的摩尔浓度。将六种重组酶（Q-MK-SpC、SpT-PMK-SnC、SnT-PMD-DC、DT-IDI-In、Jo-ispA-K和Q-FS）以等摩尔比（1:1:1:1:1:1）混合于PBS缓冲液（50 mM，pH 7.5）中，每种酶终浓度为5 μM。混合物首先在4°C、200 rpm振荡条件下孵育30 min，以使生物正交配对（SpyTag/SpyCatcher、SnoopTag/SnoopCatcher、DogTag/DogCatcher、KTag/QTag和Jo/In）之间进行初步识别和结合。随后，向混合物中加入微生物转谷氨酰胺酶（MTG；基因序列和纯化细节见补充材料），按摩尔比Q-FS:MTG = 5:1，在4°C、200 rpm振荡条件下继续孵育3 h以催化异肽键形成。交联反应后，通过离心（10,000 rpm，10 min，4°C）收集所得有序交联酶复合物（O-CLEs），并用PBS缓冲液洗涤两次以去除未结合的蛋白和过量MTG。对于催化实验，省略离心和洗涤步骤，混合物直接作为O-CLEs样品使用，以保持不同系统间一致的酶载量以进行公平比较。R-CLEs的制备过程见补充材料。
【数据】六种重组酶：Q-MK-SpC、SpT-PMK-SnC、SnT-PMD-DC、DT-IDI-In、Jo-ispA-K、Q-FS；混合比例：等摩尔比1:1:1:1:1:1；每种酶终浓度：5 μM；缓冲液：50 mM PBS，pH 7.5；初步孵育：4°C，30 min，200 rpm；MTG加入比例：Q-FS:MTG = 5:1；交联孵育：4°C，3 h，200 rpm；离心收集：10,000 rpm，10 min，4°C；洗涤：PBS缓冲液两次
2.4 表征样品制备
用于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS，Bruker，autoflex max，德国）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR，Bruker，HYPERION II，德国）、扫描电子显微镜（SEM，ZEISS，Sigma500，德国）、透射电子显微镜（TEM，Hitachi，HT-7700，日本）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM，Olympus，FV3000RS，日本）的样品制备详见补充材料。
【数据】仪器型号：MALDI-TOF-MS（Bruker autoflex max）；FT-IR（Bruker HYPERION II）；SEM（ZEISS Sigma500）；TEM（Hitachi HT-7700）；CLSM（Olympus FV3000RS）；样品制备详情：见补充材料
2.5 β-法尼烯和紫杉二烯的酶法合成
以甲羟戊酸（MVA）为底物合成β-法尼烯和紫杉二烯。反应在PBS缓冲液（50 mM，pH 7.5）中进行，含1 mM MVA、4 mM ATP、4 mM β-巯基乙醇、10 mM MgCl2、10 mM KCl、10 mM DTT，每种酶以粗可溶性裂解物形式加入，终浓度为5 μM（野生型酶或重组酶）。总反应体积为5 mL，反应在正己烷覆盖层（1 mL）下于30°C、200 rpm进行48 h（单批次反应）。对于酶循环实验，每种酶终浓度为1 μM。每个4 h催化循环在30°C、200 rpm下进行，带正己烷覆盖层（1 mL）。交联后，O-CLEs形成不溶性聚集体，可通过离心轻松沉淀。每个催化循环后，通过低温离心（10,000 rpm，5 min，4°C）回收O-CLEs，将其与反应混合物和正己烷层分离。回收的O-CLEs复合物随后通过加入新鲜底物批次中重复使用以启动下一个循环。相对活性通过将每个循环的产量归一化至第1个循环（定义为100%）来计算。
【数据】底物：MVA 1 mM；ATP：4 mM；β-巯基乙醇：4 mM；MgCl2：10 mM；KCl：10 mM；DTT：10 mM；缓冲液：50 mM PBS，pH 7.5；酶终浓度：5 μM（单批次）/1 μM（循环实验）；反应体积：5 mL；正己烷覆盖层：1 mL；反应条件：30°C，200 rpm，48 h（单批次）；循环条件：30°C，200 rpm，每循环4 h；回收离心：10,000 rpm，5 min，4°C；相对活性归一化：第1循环=100%
2.6 分析方法
通过离心（10,000 rpm，5 min）收集上层正己烷层，并通过气相色谱（GC）分析。反应完成后，正己烷层用无水硫酸钠干燥，并通过有机膜过滤器过滤。产物通过GC（Agilent 7890A，Santa Clara，CA，美国）和气相色谱-质谱联用（GC–MS，Agilent 8890-7000E，Santa Clara，CA，美国）使用HP-5柱进行分析。进样体积为1 µL。对于β-法尼烯分析，GC柱温程序如下：60°C维持1 min，然后以20°C/min升至200°C（保持1 min），最后以20°C/min升至250°C（保持1 min）。紫杉二烯通过GC–MS在以下条件下分析：初始温度110°C保持1 min，然后以30°C/min升至300°C保持6 min。质谱仪在电子电离（EI）模式下操作，电压70 eV，离子源温度230°C，四极杆温度150°C，扫描范围m/z 10–500。
【数据】离心条件：10,000 rpm，5 min；GC型号：Agilent 7890A；GC-MS型号：Agilent 8890-7000E；色谱柱：HP-5；进样体积：1 µL；β-法尼烯GC程序：60°C 1 min→20°C/min→200°C 1 min→20°C/min→250°C 1 min；紫杉二烯GC-MS程序：110°C 1 min→30°C/min→300°C 6 min；EI电压：70 eV；离子源温度：230°C；四极杆温度：150°C；扫描范围：m/z 10–500
研究结果
3.1 重组酶的构建、表达与结构分析
生物正交化学提供了高效的酶固定化策略，其关键优势在于能够通过位点特异性共价缀合精确控制酶分子的空间排列和取向。通过使用生物正交配对，多个酶可以自组装成O-CLEs。SpyTag/SpyCatcher（SpT/SpC）配对（图1c）来源于化脓性链球菌FbaB蛋白的CnaB2结构域，在SpyTag Asp117和SpyCatcher Lys31之间自发形成异肽键。SnoopTag/SnoopCatcher（SnT/SnC，图1d）和DogTag/DogCatcher（DT/DC，图1e）系统来源于肺炎链球菌黏附素RrgA的结构域4，其分裂位点不同：SnT/SnC为N型分裂，而DT/DC为C型分裂。Jo/In配对（图1f）来源于RrgA的结构域2，同样介导自发异肽键形成。此外，微生物转谷氨酰胺酶（MTG）催化谷氨酰胺和赖氨酸残基之间的共价交联（图1g）。因此，QTag和KTag肽标签通过异肽键形成实现MTG介导的蛋白连接。所有上述生物正交配对均以明确的1:1化学计量特异性介导蛋白连接。
为组装六酶O-CLEs，选择了高度特异性的生物正交配对以确保可控和准确的组装。所有野生型酶均成功表达和纯化（补充材料）。通过基因工程将生物正交配对精确插入目标酶的N端和C端，实现六种重组酶的定向组装。重组酶的理论分子量如下：Q-MK-SpC，46.5 kDa；SpT-PMK-SnC，56.3 kDa；SnT-PMD-DC，55.8 kDa；DT-IDI-In，41.4 kDa；Jo-ispA-K，45.1 kDa；Q-FS，71.8 kDa。为验证这些重组酶的成功表达和纯化，进行了SDS-PAGE分析。图2a-f中的SDS-PAGE结果显示，每种蛋白在预期分子量处均显示清晰的目标条带，表明在大肠杆菌系统中成功表达且纯度良好。为进一步确定重组酶的精确分子量，采用MALDI-TOF-MS进行精确测量（图2a-f）。每种重组酶的实验测定分子量与理论预测高度一致，误差范围满足MALDI-TOF-MS检测要求。这些结果表明，所有六种重组酶均在大肠杆菌中成功构建和表达，为后续有序多酶组装和体外级联研究提供了可靠的蛋白来源。
为评估重组酶的结构保留情况，采用了计算与实验相结合的方法。首先，使用AlphaFold3（https://alphafoldserver.com）预测野生型（WT）和重组酶的三维结构。使用PyMOL比较重组酶与野生型酶的蛋白结构，计算出较低的均方根偏差（RMSD）值（图2g-l）。这些结果证实，重组酶的整体折叠和关键催化残基保持高度保守，工程化过程中未引入重大结构扰动。为在二级结构层面进一步验证这些预测，进行了FT-IR分析。酰胺I带（1600–1700 cm−1）主要对应蛋白骨架的C=O伸缩振动，其位置和形状对α-螺旋和β-折叠等二级结构敏感。酰胺II带（1500–1600 cm−1）主要与肽骨架的变形振动相关，涉及N-H弯曲和C-N伸缩模式的组合，同样响应局部构象变化。结果显示，重组酶（红色曲线，见补充材料）和野生型酶（黑色曲线，见补充材料）在酰胺I和酰胺II区域的吸收峰位置无显著位移，且均具有强吸光度。综合SDS-PAGE、FT-IR和AlphaFold分析表明，每种重组酶在与生物正交标签融合后整体折叠得以保留。然而，这些静态测量虽表明整体折叠保留，但不能排除局部动态变化或活性位点部分遮蔽的可能性。因此，需要通过催化功能实验进一步验证。尽管如此，我们通过ATP含量测定试剂盒监测ATP消耗，测量了MK、PMK和PMD（MVA通路中三个消耗ATP的酶）及其相应重组酶的比活性。重组酶（Q-MK-SpC、SpT-PMK-SnC和SnT-PMD-DC）保留了与相应野生型酶（MK、PMK和PMD）相当的催化活性，比活性分别为：MK 0.86 ± 0.09 U/mg vs. 0.98 ± 0.03 U/mg，PMK 0.49 ± 0.07 U/mg vs. 0.50 ± 0.01 U/mg，PMD 0.14 ± 0.04 U/mg vs. 0.15 ± 0.04 U/mg（见补充材料）。这些表明引入的标签未显著损害这些酶的催化功能。对于IDI、ispA和FS，由于本实验室缺乏合适的底物和直接检测方法，无法进行准确的动力学表征。未来工作将集中于建立这些中间体的灵敏分析方法和进行完整级联的详细动力学分析。
【数据】重组酶理论分子量：Q-MK-SpC 46.5 kDa；SpT-PMK-SnC 56.3 kDa；SnT-PMD-DC 55.8 kDa；DT-IDI-In 41.4 kDa；Jo-ispA-K 45.1 kDa；Q-FS 71.8 kDa；比活性：MK 0.86 ± 0.09 U/mg（重组）vs. 0.98 ± 0.03 U/mg（野生型）；PMK 0.49 ± 0.07 U/mg（重组）vs. 0.50 ± 0.01 U/mg（野生型）；PMD 0.14 ± 0.04 U/mg（重组）vs. 0.15 ± 0.04 U/mg（野生型）；FT-IR酰胺I带：1600–1700 cm−1；酰胺II带：1500–1600 cm−1；结构预测工具：AlphaFold3；结构比较工具：PyMOL
3.2 六酶组装体的表征与顺序确认
多酶系统中组装顺序的验证至关重要，因为它直接决定底物通道是否有效建立。为验证生物正交配对的体外组装能力和O-CLEs的组装顺序，采用SDS-PAGE和CLSM进行分析。如图3a所示，展示了重组酶之间生物正交配对的结果。与单酶样品相比，双酶复合物样品的电泳迁移率出现明显偏移，表明形成了更高分子量的复合物。本研究中使用的每个生物正交配对均得到验证。在图3b中，将Q-MK-SpC（泳道1）与SpT-PMK-SnC（泳道2）在4°C孵育2 h后形成了双酶复合物（方框区域，泳道3），证实了SpyTag和SpyCatcher之间的高效共价连接。类似地，将SpT-PMK-SnC（图3c，泳道1）和SnT-PMD-DC（图3c，泳道2）孵育产生了双酶复合物条带（图3c，方框区域，泳道3），验证了SnoopTag和SnoopCatcher之间的特异性共价结合。如图3d所示，将SnT-PMD-DC（泳道1）与DT-IDI-In（泳道2）混合产生了清晰的双酶复合物（泳道3，方框），表明DogTag/DogCatcher介导的重组PMD和IDI之间的有效缀合。Jo/In配对同样促进了高效交联，如图3e所示，DT-IDI-In（泳道1）和Jo-ispA-K（泳道2）孵育后形成双酶复合物（方框区域，泳道3）。此外，MTG催化的KTag和QTag之间的交联在图3f中得到证实，其中Jo-ispA-K（泳道1）和Q-FS（泳道2）在4°C孵育2 h后产生了双酶复合物（方框区域，泳道3）。这些双酶复合物条带的出现共同表明……
【数据】交联孵育条件：4°C，2 h；验证方法：SDS-PAGE、CLSM；生物正交配对：SpyTag/SpyCatcher、SnoopTag/SnoopCatcher、DogTag/DogCatcher、Jo/In、KTag/QTag（MTG催化）；泳道信息：图3b Lane 1 Q-MK-SpC，Lane 2 SpT-PMK-SnC，Lane 3 交联样品；图3c Lane 1 SpT-PMK-SnC，Lane 2 SnT-PMD-DC，Lane 3 交联样品；图3d Lane 1 SnT-PMD-DC，Lane 2 DT-IDI-In，Lane 3 交联样品；图3e Lane 1 DT-IDI-In，Lane 2 Jo-ispA-K，Lane 3 交联样品；图3f Lane 1 Jo-ispA-K，Lane 2 Q-FS，Lane 3 交联样品
讨论与解读
本研究开发了一种基于生物正交组装的体外模块化多酶级联系统，利用缩短的甲羟戊酸通路中的六个酶实现高效萜类生物合成。通过位点特异性共价组装，该策略实现了酶的精确空间组织，增强了底物通道效应，同时减少了中间体扩散损失。利用该系统成功合成了β-法尼烯和紫杉二烯，展现出改善的催化效率、增强的操作稳定性和优异的整体级联性能。与游离酶系统相比，该策略具有多重优势：级联酶可直接从细胞裂解物中固定化而无需单独纯化，简化了制备流程；有序组装促进代谢通道效应和酶协同作用，提高产物产量并减少副反应；模块化设计可通过替换下游酶灵活适配不同萜类产物。此外，有序交联酶复合物表现出良好的重复使用性，六次循环后仍保留62 ± 9%的初始活性，紧凑的微环境提供了对苛刻条件的部分保护。未来研究可聚焦于工业规模生产、酶空间排列和化学计量的优化，以及向其他天然产物生物合成通路的拓展。
编译者解读： 该研究的方法学亮点在于用五对生物正交标签实现六酶定向组装，绕开了传统融合蛋白策略中连接肽长度和顺序难以精确控制的痛点。直接从裂解物固定化省去纯化步骤，在成本上具有实际优势。不过，六酶级联的β-法尼烯产量仅49.08 mg/L，距工业发酵水平仍有数量级差距；ATP和MVA底物的成本也限制了规模化前景。IDI、ispA和FS缺乏动力学数据，使得通路限速步骤尚不明确——这恰是后续优化的关键切入点。
参考来源
期刊：Bioresource Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135232
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135232