来源：Pulsed coaxial dielectric barrier discharge plasma loop-tubing system for inactivation of Escherichia coli K12 in glucose solution: Microbial and physicochemical kinetics and machine learning - Based predictive modeling（Journal of Food Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
冷等离子体作为一种非热杀菌技术，在热敏性液体食品加工中颇具潜力，但连续流系统中的脉冲暴露模式及其与理化性质的耦合关系尚不清楚。本研究构建了脉冲同轴介质阻挡放电（PCDBD）等离子体环管系统，在1、2、3 l/min三种流速下处理5%葡萄糖溶液中的大肠杆菌K12。总等离子体暴露时间仅46.9 s，却实现了显著灭活。研究结合IoT在线传感、动力学建模与人工神经网络预测，系统揭示了流速、等离子体停留时间与灭活效率之间的关系，并比较了ANN、梯度提升和随机森林三种模型在噪声条件下的稳健性。
研究背景
冷等离子体是中性气体经高压电场或电磁波激发后形成的电离气体，含有活性物种、电子、离子、自由基、光子及紫外辐射。它能在不显著破坏营养成分、色泽、风味和生物活性物质的前提下实现微生物灭活，因而适合处理果汁、功能性饮料和药用溶液等热敏产品。在各类等离子体发生配置中，介质阻挡放电（DBD）系统因操作简便、安全性好、可扩展且重复性高，在食品领域研究最为广泛。然而现有DBD系统多局限于小规模批次装置，处理体积从几微升到1 L不等。液体深层处理面临电或电磁能量穿透有限的难题。与批次等离子体研究中对电压、频率和气体组成的广泛评估不同，连续流系统受到的关注远远不足。
研究方法
2.1 样品制备
将一水合D-葡萄糖溶解于过滤蒸馏水中，配制5%（w/v）D-葡萄糖溶液。为消除细菌污染，使用孔径0.44 μm的Whatman膜过滤器在真空下过滤溶液，无菌转移至预灭菌的金属化储存袋中，并在1 h内用于后续步骤，以最大程度降低再污染风险。
【数据】葡萄糖浓度：5%（w/v）；滤膜孔径：0.44 μm；保存时间：1 h内使用
2.2 微生物制备
#### 2.2.1 菌种制备
大肠杆菌K12（NCTC 10538）冻干粉购自Thai Can Biotech Co., Ltd.（泰国）。将冻干细胞复溶后，先在胰蛋白酶大豆肉汤（TSB；Difco™, MD, USA）中于37 °C培养24 h进行初步复苏。复苏后的培养物在新鲜TSB中再培养两次，以确保细胞旺盛生长。为长期保存，将第二次传代培养物与无菌甘油混合至终浓度65%（v/v），以1:1比例分装，储存于−80 °C。
【数据】菌株：大肠杆菌K12（NCTC 10538）；培养基：TSB；温度：37°C；时间：24 h；甘油终浓度：65%（v/v）；保存温度：−80°C
#### 2.2.2 培养扩增
将TSB中的大肠杆菌K12培养物每日转移至新鲜培养基中以保持细胞活力。工作培养物通过将0.1 ml先前培养的TSB样品接种到10 ml新鲜TSB中制备。连续两次传代培养均在37 °C下孵育24 h。最终传代培养物置于250 rpm摇床培养箱中，以确保最佳通气和均匀生长。通过1800 × g离心10 min收获稳定期细胞。细胞沉淀用5%葡萄糖溶液冲洗两次，以去除残留的肉汤成分。洗涤后的细胞重悬于10 ml 5%葡萄糖溶液中，达到约9 log CFU/ml的细胞浓度。然后将全部细胞储备液接种到2150 ml 5%葡萄糖溶液中，使最终浓度约为7 log CFU/ml。将此悬浮液装入等离子体管路系统。
【数据】接种量：0.1 ml至10 ml TSB；温度：37°C；时间：24 h；转速：250 rpm；离心力：1800 × g；离心时间：10 min；洗涤液：5%葡萄糖溶液；重悬体积：10 ml；重悬浓度：约9 log CFU/ml；接种体积：2150 ml；最终浓度：约7 log CFU/ml
2.3 冷等离子体处理
脉冲同轴介质阻挡放电等离子体环管系统（PCDBD）的设计如图1所示。
等离子体在大气压下产生，输入功率500 W，放电电压1.2 kV，频率13 kHz。冷等离子体模块配备19 cm长的同轴等离子体发生器（A区），由位于中心核心的高压钨电极和构成外层的接地铝电极组成。指定的等离子体暴露区由内外石英管之间的环形间隙限定，液体样品通过该间隙循环流动。离开等离子体暴露区后，液体通过不锈钢管路再循环，不接收任何额外电能输入，直至重新进入等离子体暴露区。这种循环流动安排形成了脉冲等离子体方案，其特征是暴露和非暴露间隔交替。在管路系统的样品入口/出口处（B点）设置了一个封闭采样室，配备紫外（UV）灯。每次实验运行前，采样室内部用UV光照射30 min，以最大程度减少装载和采样过程中的微生物污染。然后，在样品入口点引入2160 ml样品，连续泵送通过PCDBD环管系统1200 s（20 min）。考察了三种流速（1、2和3 l/min）。流量控制由可编程逻辑控制器（PLC；型号FX3U，三菱电机株式会社，日本）（C点）通过调节供给泵的变频器频率实现。稳定的流量由集成流量传感器（D点）和比例-积分-微分（PID）控制算法的闭环反馈系统保证。在采样口（B点）以200 s间隔无菌采集样品。使用IoT在线传感器以10 s间隔实时记录样品性质，包括ORP、pH、EC和T。在循环流动回路内（E区）安装了pH传感器（型号RK500-12）、EC和T传感器（型号RK500-13）以及ORP传感器（型号RK500-06）（湖南日卡电子科技有限公司，中国）。所有传感器在测量前均按制造商规格校准，并连接至PLC单元进行连续数据记录。
【数据】输入功率：500 W；放电电压：1.2 kV；频率：13 kHz；等离子体发生器长度：19 cm；样品体积：2160 ml；处理时间：1200 s（20 min）；流速：1、2、3 l/min；UV照射时间：30 min；采样间隔：200 s；传感器记录间隔：10 s；传感器型号：pH RK500-12、EC/T RK500-13、ORP RK500-06
2.4 微生物计数
将1 ml样品在9 ml 0.1%蛋白胨水中进行系列稀释。然后，采用薄琼脂层（TAL）技术，将选定稀释液的0.1 ml等分试样以双份平板涂布。对于大肠杆菌K12计数，使用胰蛋白酶大豆琼脂（TSA；Difco, Becton Dickinson Co., Sparks, MD, USA）作为非选择性培养基。MacConkey琼脂（MAC；Difco, Becton Dickinson Co.）作为选择性培养基。平板在37 °C下孵育24 h。计数菌落形成单位（CFU）以确定活细胞浓度。
【数据】样品体积：1 ml；稀释液：9 ml 0.1%蛋白胨水；涂布体积：0.1 ml；非选择性培养基：TSA；选择性培养基：MAC；孵育温度：37°C；孵育时间：24 h
2.5 反应动力学与响应参数的数学建模
#### 2.5.1 一级建模
应用一级模型量化响应变量（如理化变化和微生物计数）随时间的变化。实验数据拟合经典化学反应动力学模型和Baranyi模型。化学反应动力学模型可表达如下（Aamir and Boonsupthip, 2017）：
(1) dC/dt = −kC^n
其中k为速率常数，C为时间t时理化性质的定量指标，n为反应级数（n = 0, 1, 2）。模型表达如下：
(2) 零级，n = 0：C_t = C_o – kt
(3) 一级，n = 1：ln C_t = ln C_o – kt
(4) 二级，n = 2：1/C_t = 1/C_o + kt
其中C_o和C_t分别为时间=0和t时的品质值。
Baranyi模型用于描述具有迟滞期、对数和尾部阶段的非线性微生物灭活或生长曲线（Uddin and Boonsupthip, 2019）。模型方程为非自治、可分离的一阶常微分方程：
(5) X(t) = ln(X_o) + μ_max · A(t) − (1/m) · ln(1 + ((exp(μ_max · m · A(t) − 1))) / exp(m · X_min))
(6) A(t) = t + (1/μ_max) · (ln · ((exp(−μ_max t + q_0 / (1 + q_0)))))
(7) q_0 = 1 / (exp(h_o) − 1)
(8) h_0 = U_max · λ（迟滞时间）
其中X(t)为时间t（h）时的微生物种群。X(t) = −ln(N_t/N_0)。N_t和N_0分别为时间t和0时的微生物种群（CFU/ml）。μ_max为最大比灭活速率。X_0为t = 0时的初始微生物种群。X_0 = −ln(N_0/N_0)。X_min为灭活的最小微生物种群（X_min = A）。m为表征从指数期向稳定期过渡的曲率参数（m = 1）。Q_0为量化初始生理状态的无量纲参数。H_0为初始生理状态参数。λ为调整期/无微生物数量差异（h）。Baranyi模型使用非线性最小二乘法拟合。拟合优度使用决定系数（R²）和均方根误差（RMSE）评估。
【数据】反应级数：n = 0, 1, 2；Baranyi模型曲率参数：m = 1；拟合方法：非线性最小二乘法；评估指标：R²、RMSE
#### 2.5.2 二级建模
选择流速作为主要环境因子，因为它直接控制每个流体元素在等离子体区（图1中A区）和非等离子体区（图1中管路系统其余部分）的停留时间。因此，它控制每次通过的等离子体剂量和脉冲暴露频率。为捕捉这些效应，引入了三个衍生操作描述符：每周期等离子体停留时间（D₁）、每周期非等离子体停留时间（D₂）和固定处理期间的总循环次数（D₃）。这些描述符概括了微生物种群经历的脉冲水动力学状态。D₁和D₂根据回路中等离子体和非等离子体部分的已知内部体积以及施加的体积流速获得，遵循反应器流体动力学原理。
研究结果
3.1 大肠杆菌K12的生长特征
大肠杆菌K12的生长曲线遵循三阶段模式（图3）。
迟滞期或细胞适应期（约5.43 ± 0.09 log CFU/ml接种量）持续约1 h。迟滞期定义为代表初始迟滞期趋势的直线（线A）与通过指数生长期最大斜率区域绘制的切线（线B）之间的交点，对应图3中的a点。随后种群进入快速指数期，增至9.03 ± 0.06 log CFU/ml。接种后24 h出现必需营养素耗竭和代谢副产物积累，培养物进入稳定期。稳定期的起始点定义为通过指数生长期最大斜率区域绘制的切线（线B）与代表稳定期开始的趋势线（线C）之间的交点，对应图3中的b点。稳定期大肠杆菌因膜重塑、保护性溶质积累和全局应激调节因子激活而对环境胁迫具有抗性（Mañas and Mackey, 2004; Berney et al., 2006）。本研究中，使用24 h培养的早期稳定期培养物作为等离子体灭活实验的接种物。它们生理上强健、均一且耐胁迫，为评估消毒效果提供了可靠的基线。
【数据】迟滞期接种量：约5.43 ± 0.09 log CFU/ml；迟滞期时长：约1 h；指数期终浓度：9.03 ± 0.06 log CFU/ml；稳定期起始时间：接种后24 h
3.2 脉冲暴露特征
在PCDBD环管系统中，样品以受控流速（Q）1、2和3 l/min循环。在整个1200 s处理期间（t_total），流速保持稳定（图4）。
实际测量的平均值（Q̄）分别为0.99 ± 0.10、1.98 ± 0.20、2.97 ± 0.30 l/min（表3）。每种流速改变了每次通过时在等离子体接触和非接触管段中花费的时间。这些间隔使用系统几何形状和操作体积（2160 ml）估算。在固定的1200 s处理期间，较低流速产生较长的每次通过等离子体停留时间（D₁）和每次通过非等离子体停留时间（D₂），因此导致总循环次数（D₃）较少（表3）。所有测试流速条件下，总累积冷等离子体停留时间（D₁ · D₃）相等（46.9 s）。它仅占总处理时间（1200 s）的一小部分。尽管短暂，这一累积接触期足以实现显著的大肠杆菌K12灭活（见3.3节讨论）。冷等离子体能量暴露和非暴露模式呈现脉冲特征（图5）。
振荡能量峰的存在对应等离子体接触间隔、短暂保持阶段和非接触阶段的能量衰减。在较低流速下，这些能量脉冲更宽，持续时间更长但发生频率更低。这种不同的脉冲模式可能影响大肠杆菌灭活的整体效果。每个循环中更宽的脉冲被认为可延长相互作用时间并促进短寿命和长寿命活性物种的大量形成。因此，即使在直接等离子体接触区之外，也能增强累积抗菌效果。等离子体接触期间形成的活性物种可能在溶液中持续存在并保持活性，在随后的非接触间隔中逐渐反应或消散。通过这种循环通过，递送至样品的累积冷等离子体能量在处理期间不断积累。样品-冷等离子体停留时间可能是控制电离物种形成和稳定性以及UV诱导化学转化持续性的关键参数。
【数据】流速设定值：1、2、3 l/min；实测平均流速：0.99 ± 0.10、1.98 ± 0.20、2.97 ± 0.30 l/min；处理时间：1200 s；操作体积：2160 ml；总累积等离子体停留时间：46.9 s；总处理时间：1200 s
3.3 大肠杆菌K12灭活
5%葡萄糖基质中的大肠杆菌K12悬浮液被PCDBD环管系统有效灭活。随着处理时间增加，细菌种群显著下降（图5）。等离子体-微生物相互作用主要受脉冲和连续处理条件下累积等离子体暴露时间的控制（Birania et al., 2022; Wang et al., 2023）。本研究首次提供了PCDBD环管配置中脉冲等离子体效应的证据。尽管该循环回路系统中的等离子体暴露以离散脉冲间隔发生，整体处理效果仍受处理时间控制。大肠杆菌K12以阈值依赖的非线性方式响应。其灭活进展经历迟滞期、指数期和稳定（拖尾）期。这归因于微生物种群异质性和灭活过程的固有局限性（Samioti et al., 2024）。初始迟滞（肩部）表明细胞并非在等离子体暴露后立即被灭活。它们可能经历了等离子体诱导损伤的积累，但至少部分被细胞防御和修复机制抵消。只有在氧化应激和结构损伤达到临界“灭活阈值”后，才出现快速的对数线性灭活。这一陡峭的初始阶段反映了直接暴露于高通量等离子体生成活性物种（如活性氧物种ROS，包括羟自由基和臭氧、活性氮物种RNS和UV光子）的易感细胞的快速破坏（Hertwig et al., 2015; Patange et al., 2019）。据报道，这些物种对细胞膜、核酸和关键代谢途径诱导致命性氧化损伤（Mošovská et al., 2023; Privat-Maldonado et al., 2019）。最终渐近阶段意味着存在高度抗性的亚群（Mošovská et al., 2023; Patange et al., 2019）。这可能与细胞聚集、微菌落形成或与保护性基质结合导致等离子体生成物种的可及性和效力受限有关。此外，生理多样性（如休眠或胁迫状态下的持久性）可能有助于在延长等离子体暴露下持续存活。处于此类条件的细胞通常启动应激反应机制或改变膜特性以抵御氧化攻击（Akki et al., 2022）。“最大死亡”或平台期表明存活细胞受到有效保护（如嵌入团簇或碎片中），尽管继续施加等离子体，不再经历致命性活性物种剂量。发现样品流速显著影响大肠杆菌K12灭活程度。在较低流速（1 l/min）下，微生物减少量更大（约1.5 Log CFU/ml，对应46.9 s累积等离子体停留时间）（图5）。虽然每个样品的固定总等离子体暴露时间（46.9 s）不变，但较低流速意味着较少的循环次数但每个循环的等离子体暴露时间延长（表3）。这增加了等离子体暴露区内的停留时间。它可能促进更高局部浓度的活性物种。如此大量的活性物种可能增强与细菌细胞、水和有机溶质（包括葡萄糖）的直接相互作用。因此，灭活效果似乎更依赖于每次通过的等离子体暴露持续时间，而非通过次数或总暴露时间。Han et al. (2022)强调，停留时间和剂量分布都是优化连续流等离子体系统中微生物灭活的关键参数。每个循环中延长的接触期可能促进长寿命活性物种（如过氧化氢和亚硝酸盐）的形成，这些物种持续存在并在回路的无等离子体段继续发挥抗菌作用。大多数先前关于冷等离子体微生物灭活的研究集中在提供连续而非脉冲等离子体暴露的系统。
【数据】最大微生物减少量：约1.5 Log CFU/ml（1 l/min流速，46.9 s累积等离子体停留时间）；总等离子体暴露时间：46.9 s；流速：1、2、3 l/min
讨论与解读
本研究证明，PCDBD等离子体环管系统可在连续流脉冲等离子体操作下有效灭活5%葡萄糖溶液中的大肠杆菌K12。流速Q是主导操作参数。较低流速对应较长的每周期等离子体停留时间D₁，导致更高的最大微生物灭活速率、更短的迟滞期和更大的最终减少量。基于IoT的在线传感揭示了理化性质的线性时间变化。ORP和pH降低以及EC和温度升高遵循伪零级动力学。在这些指标中，ORP与微生物灭活的相关性最强且最一致，因此适合作为主要实时控制变量。温度变化较小且与致死率不相关。微生物灭活遵循S形伪动力学，Baranyi模型描述良好。基于D₁的二级Ratkowsky型模型以及纳入脉冲等离子体特征（D₁、D₂和D₃）的交互多项式模型，在表达理化和微生物伪动力学参数方面比基于流速Q的Ratkowsky型模型更有效。这些结果表明，在连续流脉冲等离子体系统中，每周期等离子体停留时间而非流速和总累积暴露时间主导微生物灭活效率。
编译者解读： 该研究的亮点在于将脉冲等离子体暴露与IoT实时传感、动力学建模和机器学习预测整合为一个闭环框架。ORP作为主要控制变量的识别具有工程实用价值——相比温度或pH，ORP响应更快且与灭活相关性最强。ANN在噪声和插值条件下优于GBM和RF，说明非线性映射能力对复杂等离子体-液体体系的建模至关重要。局限在于：仅验证了单一葡萄糖基质和单一菌株，实际食品体系的复杂基质效应（如蛋白质、多酚的抗氧化干扰）尚未涉及；46.9 s累积暴露时间的灭活上限约1.5 Log，距工业灭菌要求（>5 Log）仍有差距，需通过多级串联或更高功率密度来弥补。
参考来源
期刊：Journal of Food Engineering, 2027
DOI: 10.1016/j.jfoodeng.2026.113154
DOI: 10.1016/j.jfoodeng.2026.113154