来源：The VvMYBA1-VvWRKY44-VvMYB308 transcription factor cascade regulates the biosynthesis of anthocyanin in leaves of red-fleshed grape（Scientia Horticulturae）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
花青素决定植物组织着色，但红肉葡萄叶片花青素积累的调控机制尚不清楚。本研究以红肉葡萄'中山红玉'与'阳光玫瑰'杂交后代中的红叶株系H4和绿叶株系L为材料，鉴定出在H4中高表达的WRKY转录因子VvWRKY44。该蛋白定位细胞核，过表达可提高烟草花青素含量及多个合成基因转录水平。机制上，VvWRKY44直接结合并激活VvF3H启动子，且受上游VvMYBA1靶向激活，同时被VvMYB308通过转录抑制和蛋白互作双重机制拮抗。研究揭示了一条VvMYBA1-VvWRKY44-VvMYB308调控模块。
研究背景
花青素是天然水溶性色素，属于类黄酮家族，广泛分布于植物界。目前已发现超过600种天然花青素，植物中最常见的花青素苷元包括矢车菊素、飞燕草素、芍药花素、天竺葵素、锦葵素和矮牵牛素，它们主要赋予花瓣、果实和种皮颜色。葡萄是全球种植最广的果树作物之一，因其独特外观和风味深受消费者青睐。浆果颜色反映成熟度和风味，已成为决定鲜食葡萄市场价值的关键品质性状。目前广泛栽培的鲜食葡萄品种中，花青素几乎仅存在于果皮。染色葡萄（Teinturier）是酿酒葡萄的一个特殊类群，其花青素不仅在果皮积累，也在果肉中积累。'中山红玉'是一种新型红肉葡萄种质，以强花青素合成能力著称，其果肉和果皮均富含花青素，叶片在秋季因花青素积累而变红。葡萄浆果花青素积累受……（原文此处截断）。
研究方法
2.1 实验材料
植物样品为'阳光玫瑰'（SM，绿肉/绿叶）与'中山红玉'（ZS-HY，红肉/秋季红叶）杂交获得的4至5年生幼苗，种植于中国南京江宁。后代在果实与叶片颜色性状间表现出连锁关系。选取两个优良单株L（绿色表型）和H4（红色表型）用于本研究。
【数据】材料：'阳光玫瑰'×'中山红玉'杂交后代；树龄：4-5年；地点：中国南京江宁；株系：L（绿叶）、H4（红叶）；原文未详述其他参数
2.2 总花青素含量测定
总花青素含量参照Wang Q等（2019）描述的方法测定。简要而言，取1 g植物组织在液氮中研磨，用含1%甲酸的甲醇提取，随后超声处理并离心。收集上清液，使用NanoDrop ND-1000分光光度计分析，每个样品三个生物学重复。
【数据】样品量：1 g植物组织；提取液：含1%甲酸的甲醇；仪器：NanoDrop ND-1000分光光度计；生物学重复：3个；原文未详述超声时间、离心转速等参数
2.3 花青素测定取材与RNA提取及RT-qPCR
花青素测定时，葡萄叶片取自L和H4，烟草花瓣取自野生型和VvWRKY44过表达转基因株系。总RNA提取和qPCR分析参照先前描述的方法（Dong et al., 2023），使用RNAprep Pure Plus Kit（天根，中国）进行RNA分离，使用TaKaRa反转录试剂盒合成cDNA。烟草样品以NtUbiquitin基因作为内参，相对表达量通过2–ΔΔCT方法计算。
【数据】葡萄叶片来源：L和H4；烟草花瓣来源：野生型和VvWRKY44过表达株系；RNA提取试剂盒：RNAprep Pure Plus Kit（天根）；反转录试剂盒：TaKaRa；内参基因：NtUbiquitin；计算方法：2–ΔΔCT；原文未详述RNA提取和反转录的具体操作参数
2.4 转基因烟草分析取材、系统发育关系与结构域分析
葡萄叶片分析时，总RNA从L和H4葡萄叶片中提取。转基因烟草分析时，总RNA从野生型和VvWRKY44过表达转基因烟草株系的 petals 和叶片1:1混合物中提取。从NCBI在线平台下载与VvWRKY44同源的蛋白序列。使用MEGA11进行多序列比对，使用ESPript 3.0展示比对结果。随后使用MEGA11构建邻接法（Neighbor-Joining）系统发育树，bootstrap值基于1000次重复计算。为鉴定VvWRKY44中的保守结构域，检索了NCBI保守结构域数据库（CDD [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi]）。
【数据】烟草RNA提取材料：花瓣和叶片1:1混合物；比对软件：MEGA11；比对展示：ESPript 3.0；系统发育树方法：Neighbor-Joining；bootstrap重复：1000次；结构域数据库：NCBI CDD；原文未详述其他参数
2.5 VvWRKY44亚细胞定位
我们构建了VvWRKY44融合载体并转化至根癌农杆菌。细菌培养液稀释至OD600为0.6，随后在室温下黑暗孵育3至4小时。瞬时转化时，选取生长均匀的5周龄本氏烟草（Nicotiana benthamiana）植株。使用无针头1 mL注射器将农杆菌悬浮液 infiltrated 到叶片背面。 infiltration 后，植株在室温下保持3天（Lai et al., 2019）。使用LSM 800激光扫描共聚焦显微镜（蔡司，德国）观察并记录GFP荧光信号。
【数据】农杆菌OD600：0.6；黑暗孵育：室温、3-4 h；烟草苗龄：5周；共培养时间：室温、3天；显微镜：LSM 800（蔡司）；原文未详述农杆菌菌株、载体构建细节等参数
2.6 植物转化与表型分析
扩增VvWRKY44完整编码序列（CDS），使用ClonExpress-Entry One Step Cloning Kit（诺唯赞，南京，中国）按制造商说明插入植物表达载体pCambia1301–35S-GUS，从而生成35S::VvWRKY44-GUS构建体。随后将构建的载体质粒转入根癌农杆菌菌株GV3101（威迪，上海，中国）。烟草采用Dong Yang的方法进行稳定转化（Dong et al., 2023）。转基因植株在含50 mg/L潮霉素的半浓度Murashige and Skoog（MS）培养基上筛选。进行GUS染色以确认转基因成功整合。选择VvWRKY44表达水平最高的转基因株系OE-33用于后续表型分析。使用烟草花瓣测定总花青素含量，并对花瓣和叶片1:1混合物进行RT-qPCR以分析花青素生物合成结构基因的表达水平。
【数据】载体：pCambia1301–35S-GUS；克隆试剂盒：ClonExpress-Entry One Step Cloning Kit（诺唯赞）；农杆菌菌株：GV3101（威迪）；筛选培养基：半浓度MS + 50 mg/L潮霉素；筛选标记：潮霉素；代表株系：OE-33；花青素测定材料：烟草花瓣；RT-qPCR材料：花瓣和叶片1:1混合物；原文未详述转化具体步骤参数
2.7 Y1H assay
'中山151'是'阳光玫瑰'×'ZS-HY'的红叶F1杂交后代，与本研究所用红叶（H4）和绿叶（L）材料来自同一杂交群体。我们从'中山151'基因组DNA中克隆了1249 bp的VvF3H启动子片段用于Y1H assay。随后将该启动子片段（proVvF3H）插入pAbAi载体，得到pAbAi-proVvF3H诱饵构建体。同时，将VvWRKY44编码序列与pGADT7中的GAL4激活域框内连接，产生 prey 构建体VvWRKY44-pGADT7。Y1H Gold酵母菌株（威迪，上海，中国）按制造商方案共转化两个构建体以评估互作。SD/-Leu和SD/-Ura培养基购自索莱宝（北京，中国），Aureobasidin A（AbA）购自翊圣（上海，中国）。
【数据】VvF3H启动子片段长度：1249 bp；启动子来源：'中山151'基因组DNA；诱饵载体：pAbAi； prey 载体：pGADT7；酵母菌株：Y1H Gold；培养基：SD/-Leu、SD/-Ura（索莱宝）；AbA：翊圣；原文未详述AbA浓度、培养温度时间等参数
2.8 双荧光素酶 assay
我们将VvF3H启动子克隆到pGreenII 0800-LUC中构建proVvF3H-LUC报告载体。将VvWRKY44编码序列插入pCambia1301–35S-GUS生成35S::VvWRKY44-GUS效应载体。我们将每个构建体与空pCambia1301–35S-GUS载体（阴性对照）分别转入根癌农杆菌GV3101。瞬时表达时，将含proVvF3H-LUC报告载体的农杆菌与效应载体或空载体对照混合， infiltration 到本氏烟草叶片。 infiltration 后72小时收获叶片。使用LB 985 N活体成像系统（Berthold Technologies，德国）检测发光。使用Dual-Luciferase®试剂盒（Promega，美国）测定萤火虫和海肾荧光素酶活性。所得LUC/REN比值作为相对启动子活性的指标。其他双荧光素酶 assay 使用相应的报告载体和效应载体遵循相同流程：proVvWRKY44-LUC与35S::VvMYBA1，以及proVvWRKY44-LUC与35S::VvMYB308。
【数据】报告载体：pGreenII 0800-LUC；效应载体：pCambia1301–35S-GUS；农杆菌菌株：GV3101；收获时间： infiltration 后72 h；成像系统：LB 985 N（Berthold Technologies）；试剂盒：Dual-Luciferase®（Promega）；原文未详述农杆菌浓度、 infiltration 条件等参数
2.9 Y2H assay
我们将VvMYB308 CDS克隆到pGADT7构建 prey 载体（pGADT7-VvMYB308），将VvWRKY44 CDS克隆到pGBKT7构建诱饵载体（pGBKT7-VvWRKY44）。阴性对照为空pGBKT7和pGADT7载体。将两个构建体共转化到Y2H Gold酵母感受态细胞（威迪，上海，中国）后，按供应商说明进行酵母双杂交 assay。SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基购自索莱宝（北京，中国）。
【数据】 prey 载体：pGADT7-VvMYB308；诱饵载体：pGBKT7-VvWRKY44；酵母菌株：Y2H Gold；培养基：SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade（索莱宝）；原文未详述培养温度时间等参数
2.10 BiFC assay
我们将VvMYB308和VvWRKY44分别克隆到YFP N端载体（YNE）和C端载体（YCE），产生VvMYB308-YNE和VvWRKY44-YCE。将这些构建体转入根癌农杆菌GV3101后，将含两个构建体的农杆菌共 infiltration 到本氏烟草叶片进行BiFC assay。 infiltration 后48–72小时使用LSM 900共聚焦显微镜（蔡司，德国）检查YFP荧光。
【数据】载体：YNE、YCE；农杆菌菌株：GV3101；检测时间： infiltration 后48–72 h；显微镜：LSM 900（蔡司）；原文未详述农杆菌浓度、 infiltration 条件等参数
2.11 EMSA
我们将VvWRKY44、VvMYBA1和VvMYB308分别克隆到His标签的pCold-TF载体以表达重组融合蛋白。将各构建体导入大肠杆菌BL21后，加入0.2 mM IPTG诱导表达，16°C孵育约12–16小时（过夜）。His标签蛋白用HisSep Ni-NTA MagBeads（翊圣，中国）纯化。EMSA时，合成并退火对应VvF3H启动子W-box和VvWRKY44启动子MYB结合元件的生物素标记双链DNA探针（GENERAL BIOL，中国），以及未标记竞争探针和突变探针。纯化蛋白与标记探针孵育，蛋白-DNA复合物与游离探针通过非变性PAGE（碧云天生物技术，中国）分离。参照Yang等（2020）方案使用ChemiDoc MP系统（Bio-Rad，美国）捕获信号。
【数据】表达载体：pCold-TF；表达菌株：大肠杆菌BL21；IPTG浓度：0.2 mM；诱导温度：16°C；诱导时间：12–16 h（过夜）；纯化材料：HisSep Ni-NTA MagBeads（翊圣）；探针标记：生物素；电泳：非变性PAGE（碧云天）；成像系统：ChemiDoc MP（Bio-Rad）；原文未详述蛋白纯化具体缓冲液、EMSA孵育条件等参数
研究结果
3.1 红肉葡萄叶片中VvWRKY44的鉴定
'阳光玫瑰'是一个叶片全年保持绿色的葡萄品种，而'中山红玉'是一个叶片在秋季变红的品种。其F1后代同时表现出两种表型。为探究潜在机制，我们选取了一个代表性绿叶株系L和一个红叶株系H4进行进一步分析（图1A）。对L和H4叶片总花青素水平的分析表明，两者颜色差异可能归因于花青素积累程度不同（图1B）。通过同一遗传背景的红叶和绿叶个体的转录组测序分析，VvWRKY44被鉴定为候选调控因子（Li H et al., 2025）。RT-qPCR显示H4的VvWRKY44转录水平显著高于L（图1C），表明叶片变红可能与花青素积累相关，且VvWRKY44可能参与该过程。构建系统发育树推断VvWRKY44与其他物种同源物的进化关系，结果显示VvWRKY44与MdWRKY44和PbWRKY26聚类较近（图1D）。多序列比对显示VvWRKY44包含两个WRKY结构域（图1F）。通过在本氏烟草叶片中瞬时表达VvWRKY44-GFP融合蛋白评估其亚细胞定位。GFP信号局限于细胞核（图1E），暗示VvWRKY44可能参与转录调控。
【数据】株系：L（绿叶）、H4（红叶）；花青素含量差异：显著（具体数值原文未详述）；VvWRKY44在H4中表达：显著高于L；系统发育：与MdWRKY44、PbWRKY26近缘；WRKY结构域：2个；亚细胞定位：细胞核；原文未详述花青素具体含量数值和表达倍数
3.2 VvWRKY44促进烟草花青素生物合成
为探究VvWRKY44在花青素积累中的功能，构建了35S::VvWRKY44过表达载体并通过农杆菌介导转化导入本氏烟草。获得两个独立转基因株系OE-2和OE-33，并经组织化学GUS染色确认，两个转基因株系叶片均显示强GUS活性，而野生型（WT）植株未检测到信号（图2A）。RT-qPCR分析显示VvWRKY44在两个株系中均成功过表达，其中OE-33转录水平高于OE-2（图2B）。因此，选择OE-33作为后续功能表征的代表株系。表型分析显示，与WT相比，OE-33花瓣颜色更深且花青素积累水平显著更高（图2C, D）。一致地，RT-qPCR分析显示多个关键花青素生物合成基因，包括NtCHI、NtDFR、NtANS、NtUFGT和Nt4CL，在OE-33中较WT植株显著上调，而NtF3H无显著差异（图2E；补充图S1）。总体而言，这些结果表明VvWRKY44正向调控烟草花青素生物合成。
【数据】转基因株系：OE-2、OE-33；GUS染色：转基因株系强活性，WT无信号；OE-33表达量：高于OE-2；花瓣花青素：OE-33显著高于WT；上调基因：NtCHI、NtDFR、NtANS、NtUFGT、Nt4CL；无显著差异基因：NtF3H；原文未详述花青素具体含量数值和基因表达倍数
3.3 VvWRKY44直接结合并激活VvF3H启动子
VvF3H编码花青素途径中的关键酶，对花青素积累至关重要（Duan et al., 2022）。为探究VvWRKY44与VvF3H的关系，我们进行了Y1H assay。将VvF3H启动子序列克隆到pAbAi载体，将VvWRKY44 CDS克隆到pGADT7载体。随后检测到VvWRKY44与VvF3H启动子之间的互作（图3A）。WRKY转录因子特异性结合启动子序列中的W-box（Ülker and Somssich, 2004）。VvF3H启动子含有一个W-box基序。EMSA结果（图3B）显示VvWRKY44-His蛋白特异性结合W-box探针，表现为迁移率改变。该迁移条带可被未标记探针竞争消除，但被突变探针恢复，证实了特异性结合。双荧光素酶报告 assay 进一步证明VvWRKY44激活VvF3H启动子活性（图3C-E）。
【数据】互作：VvWRKY44与VvF3H启动子；结合基序：W-box；EMSA：特异性结合，可被未标记探针竞争；双荧光素酶：VvWRKY44激活VvF3H启动子；原文未详述LUC/REN具体比值
3.4 VvWRKY44受VvMYBA1靶向调控
在葡萄中，VvMYBA1是控制浆果果皮颜色的主要调节因子（Kobayashi et al., 2005）。为功能验证VvMYBA1是否激活VvWRKY44启动子，我们构建了VvWRKY44启动子驱动LUC表达的报告质粒。当VvMYBA1与该报告载体在本氏烟草叶片中共表达时，荧光素酶活性较对照显著升高，表明VvMYBA1是VvWRKY44转录的上游激活因子（图4A-C）。进一步分析发现，VvWRKY44启动子中有四个MYB结合元件。在计算机分析预测的四个MYB结合元件中，EMSA assay 中仅MYB-like元件显示与VvMYBA1特异性结合，而其他三个元件未检测到结合信号或信号极弱。这表明MYB-like元件是介导VvMYBA1转录激活VvWRKY44的主要功能性顺式元件。进行EMSA验证VvMYBA1与VvWRKY44启动子的结合。VvMYBA1以特异性方式结合MYB结合元件：结合信号随竞争探针量增加而减弱，使用突变探针时未观察到竞争（图4D）。
【数据】VvWRKY44启动子MYB结合元件：4个；功能性元件：MYB-like元件；EMSA：MYB-like元件特异性结合，其余3个无或极弱结合；双荧光素酶：VvMYBA1激活VvWRKY44启动子，LUC活性显著升高；原文未详述LUC/REN具体比值和升高倍数
3.5 VvMYB308与VvWRKY44互作
Li等（2025）报道叶片颜色变化与VvWRKY44、VvMYB308等基因的表达改变直接相关。我们进行酵母双杂交（Y2H） assay 以确定VvWRKY44是否与VvMYB308互作，旨在更好地理解VvWRKY44如何调控花青素生物合成。共转化酵母（AD-VvMYB308 + BD-VvWRKY44）在-SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade（-LWHA）培养基上的生长证实了互作（图5A）。随后我们将VvWRKY44与cYFP融合、VvMYB308与nYFP融合并进行BiFC。观察到的核荧光表明两个蛋白在细胞核中互作（图5B）。单个MYB转录因子可单独调控花青素产生，但也可与其他转录因子组装成蛋白复合物（Khan and Abbas, 2023）。基于这些发现，我们推测VvMYB308-VvWRKY44互作可能对花青素调控至关重要。为检测该复合物如何影响VvF3H转录，我们使用35S::VvMYB308和35S::VvWRKY44作为效应载体、proVvF3H::LUC作为报告载体进行双荧光素酶报告 assay。结果显示VvMYB308与VvWRKY44共表达显著降低了VvWRKY44介导的VvF3H启动子激活（图5C），表明VvMYB308对VvWRKY44功能具有抑制效应。
【数据】Y2H：AD-VvMYB308 + BD-VvWRKY44在-LWHA培养基生长；BiFC：细胞核荧光；双荧光素酶：VvMYB308共表达显著降低VvWRKY44介导的VvF3H启动子激活；原文未详述LUC/REN具体比值和降低幅度
3.6 VvMYB308抑制VvWRKY44转录
我们还发现VvMYB308能结合VvWRKY44启动子。EMSA证明VvMYB308-His融合蛋白与携带VvWRKY44启动子MYB结合基序的探针互作，且该互作随竞争探针浓度增加逐渐减弱并完全消失（图6D）。为探究VvMYB308是否在转录水平调控VvWRKY44，我们进行了双荧光素酶报告 assay。将VvWRKY44启动子与LUC报告基因融合，以35S::VvMYB308作为效应载体。将效应载体和报告载体共 infiltration 到本氏烟草叶片，与对照相比发光显著减弱，证实VvMYB308作为VvWRKY44转录的直接抑制因子（图6A-C）。
【数据】EMSA：VvMYB308-His与VvWRKY44启动子MYB结合基序探针互作，竞争探针浓度增加后信号消失；双荧光素酶：VvMYB308显著抑制VvWRKY44启动子活性；原文未详述LUC/REN具体比值和降低幅度
讨论与解读
花青素是广泛认可的次生代谢物，赋予植物颜色并具有重要生理和营养功能。葡萄浆果花青素生物合成的调控机制已被广泛表征，包括MBW复合物和MYB调控因子的核心作用，但叶片等营养组织中的花青素调控受到的关注相对较少。尤其是控制葡萄叶片季节性或不发育诱导色素沉着的转录网络在很大程度上仍未解析。本研究鉴定VvWRKY44为葡萄叶片花青素积累的关键正调控因子，并阐明了一个由VvMYBA1–VvWRKY44–VvMYB308组成的分层调控模块。该调控架构通过将WRKY介导的转录调控整合到上游信号层级中，扩展了当前对花青素调控超越经典MBW框架的理解。
VvWRKY44作为转录激活因子直接调控葡萄叶片花青素结构基因。先前研究已确立花青素生物合成主要受在MBW复合物中发挥功能的R2R3-MYB转录因子控制。在葡萄中，VvMYBA1及其同源物已被……（原文此处截断）。
编译者解读：该研究在经典MBW模型之外，补充了一条WRKY参与的层级调控通路，为红肉葡萄叶片着色提供了新靶点。方法上，Y1H、EMSA、双荧光素酶和BiFC的组合验证较为严谨，但功能验证主要在烟草异源系统中完成，葡萄叶片中的遗传学证据（如瞬时沉默或稳定转化）尚缺。合成生物学应用层面，VvMYBA1-VvWRKY44-VvMYB308模块可作为多基因调控回路的设计蓝图，用于精准调控植物营养组织花青素积累，但需注意VvMYB308的双重抑制机制可能增加回路调控的复杂性。
参考来源
期刊：Scientia Horticulturae, 2026
DOI: 10.1016/j.scienta.2026.115040
DOI: 10.1016/j.scienta.2026.115040