来源：Fumigant 3-methylvaleric acid derived from medicinal plant endophytic Bacillus cereus suppresses Aspergillus niger and alleviates garlic postharvest rot via disrupting fungal metabolism and activating host defense（Postharvest Biology and Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
大蒜采后黑腐病由黑曲霉（Aspergillus niger）引起，严重降低贮藏品质与商品价值。本研究从腐烂大蒜中分离获得致病菌S15，并从半夏中筛选到拮抗内生细菌蜡样芽孢杆菌H1。HS-GC-IMS鉴定出3-甲基戊酸（3-MA）为其主要活性挥发物，对S15的最小抑制浓度为45 μL L⁻¹。3-MA通过破坏细胞壁与膜完整性、引发电解质泄漏与脂质过氧化、抑制麦角固醇合成，并扰乱核苷酸代谢、TCA循环等途径发挥抗真菌作用；贮藏试验中40 μL L⁻¹以上可完全阻断黑腐病并激活大蒜防御酶。
研究背景
大蒜（Allium sativum L.）是传统药用植物，具有抗菌、抗氧化和抗炎等广泛生物活性。中国是全球最大的大蒜生产国，产量占全球70%以上，对农民具有重要经济意义。然而，贮藏期间的高温高湿会加速劣变和病原菌侵染，造成大量采后损失。目前低温贮藏和辐照是主要保鲜手段，但前者可能导致休眠解除不充分和发芽，后者成本高昂且对多数农户不实用。因此，亟需开发安全有效的采后病害防控替代方案。
黑曲霉是一种常见的土传和气传病原菌，对大蒜及其他蔬菜造成严重危害，并具有产真菌毒素的能力。当前针对黑曲霉引起的大蒜黑腐病防控策略主要依赖接触型生防制剂和抗菌材料，而将芽孢杆菌挥发性化合物作为气相生防制剂的应用尚鲜有探索。微生物来源的挥发性有机化合物（VOCs）代表了一种新型、安全且经济可行的采后病害防控途径。
研究方法
2.1 植物材料和微生物菌株
白皮大蒜（Allium sativum L.）鳞茎购自中国甘肃省兰州市（原产地为山东省临沂市兰陵县）。半夏（Pinellia ternata）植株于2023年7月采集自中国甘肃省陇南市武都区——半夏传统产区。选取无可见病害症状的健康两年生植株，置于4℃冰盒中避光运输至实验室。去除表面土壤并用无菌去离子水冲洗后，在无菌条件下将植株分离为根、茎、叶和花。各组织经表面消毒后用于后续内生细菌分离。致病真菌（Fusarium oxysporum、Colletotrichum capsici、Botrytis cinerea、Fusarium graminearum和Phytophthora capsici）由中国科学院西北师范大学（兰州）生命科学学院植物-微生物互作研究实验室提供。
【数据】植株：半夏两年生健康植株；采集时间：2023年7月；采集地点：甘肃省陇南市武都区；运输温度：4℃；大蒜品种：白皮大蒜；大蒜来源：甘肃省兰州市（原产山东兰陵）；病原真菌：5种
2.2 病原真菌的分离与形态学表征
大蒜鳞茎在实验室环境条件（25 ± 2°C，相对湿度60–70%）下贮藏两周，使其自然发病。病鳞茎先用75%乙醇消毒1 min，再用0.1%次氯酸钠消毒3 min，用无菌蒸馏水冲洗三次，将病健交界处组织块置于PDA平板上。在28°C培养3–5天后，将长出的菌落通过单孢分离纯化，并保存于4°C的PDA斜面。
【数据】贮藏条件：25 ± 2°C，相对湿度60–70%；贮藏时间：2周；消毒：75%乙醇1 min，0.1%次氯酸钠3 min；冲洗：无菌蒸馏水3次；培养温度：28°C；培养时间：3–5天；保存温度：4°C；培养基：PDA
2.3 基于柯赫氏法则的致病性验证
从自然腐烂大蒜鳞茎中分离的三株真菌（S7、S10、S15）按照完整柯赫氏法则进行致病性验证。将各分离株的孢子悬液用无菌蒸馏水稀释并调整至统一浓度1 × 10⁷ 孢子/mL用于接种。选取大小均匀、成熟且无损伤的蒜瓣，用75%乙醇表面消毒1 min、0.1%次氯酸钠消毒3 min，无菌蒸馏水冲洗三次，无菌风干。用无菌手术刀在每个蒜瓣上制造约3 mm深、2 mm直径的伤口，每切五个蒜瓣更换一次刀片。每个伤口位点滴加20 μL孢子悬液，以无菌蒸馏水作为阴性空白对照。每个处理设三个生物学重复。所有接种大蒜样品在25 ± 2 °C、相对湿度85–95%条件下培养。在两个关键时间点拍照记录病斑扩展和真菌生长状态：第5天（早期侵染阶段）和第20天（晚期侵染阶段），以比较三株分离株的毒力差异。培养20天后，从有症状蒜瓣的病健交界处切取组织碎片，按上述方法表面消毒后置于新鲜PDA平板上进行病原菌再分离。长出的真菌菌落经单孢分离纯化，根据形态学特征和ITS序列分析进行鉴定。再分离菌株的ITS序列通过BLAST分析与相应原始分离株进行比较。
【数据】孢子悬液浓度：1 × 10⁷ 孢子/mL；接种量：20 μL/伤口；伤口规格：3 mm深、2 mm直径；消毒：75%乙醇1 min，0.1%次氯酸钠3 min；培养温度：25 ± 2°C；相对湿度：85–95%；观察时间点：第5天和第20天；生物学重复：3次；刀片更换频率：每5个蒜瓣
2.4 高抗真菌活性内生细菌的筛选与鉴定
新鲜半夏植株采集后于4℃运输至实验室。在无菌条件下分离根、茎、叶和花，用75%乙醇（1 min）和1%次氯酸钠（3 min）表面消毒，无菌蒸馏水冲洗三次。消毒组织切成0.5 cm片段，置于LB琼脂上37℃培养以分离内生细菌。挑取形态不同的菌落通过反复划线纯化。拮抗试验中，细菌分离株在LB琼脂上37°C培养24 h，然后转入LB肉汤中37°C、180 rpm振荡培养12 h。将细菌悬液（1 × 10⁸ CFU/mL）均匀涂布于LB琼脂平板上。将病原真菌以6 mm菌丝饼接种于PDA平板中央。LB平板置于下方，PDA平板倒扣于上方，两培养基相对。28°C培养5天后，测量真菌菌落直径并按以下公式计算抑制率：抑制率（%）= (Dc − Dt) / (Dc − D₀) × 100。其中Dc为对照菌落直径，Dt为处理菌落直径，D₀为初始菌饼直径（6 mm）。所有实验设三个重复。拮抗细菌的基因组DNA采用煮沸裂解法提取。16S rRNA基因经PCR扩增后由甘肃金瑞生物科技有限公司（兰州）测序。使用MEGA 11软件以邻接法构建系统发育树以确定分类地位。
【数据】运输温度：4℃；消毒：75%乙醇1 min，1%次氯酸钠3 min；组织片段：0.5 cm；初筛培养：LB琼脂，37℃；液体培养：LB肉汤，37°C，180 rpm，12 h；细菌悬液浓度：1 × 10⁸ CFU/mL；真菌菌饼直径：6 mm；拮抗培养温度：28°C；培养时间：5天；重复：3次
2.5 VOCs对黑曲霉体外生长的影响
蜡样芽孢杆菌H1产生的VOCs对黑曲霉S15的拮抗活性采用2.4节所述双皿法评估。菌丝生长抑制率（MGI）按文献公式计算。对照为PDA平板含真菌饼与未接种LB平板配对。
【数据】方法：双皿法；对照：PDA+真菌饼/未接种LB平板；原文未详述具体培养温度和时间
2.6 VOCs成分分析
蜡样芽孢杆菌H1的VOCs按先前描述方法鉴定。将菌悬液接种于顶空瓶中的5 mL LB琼脂上，37 °C培养3天。从顶空收集挥发性化合物，在山东政法学院司法鉴定中心（济南）通过HS-GC-IMS进行分析。进样前样品在40 °C孵育20 min。GC分离在MXT-5色谱柱上进行，柱温60 °C，以N₂为载气（初始2 mL/min维持10 min，然后增至10 mL/min）。IMS分析在45 °C下进行，使用N₂漂移气，流速150 mL/min。数据使用VOCal软件及三个插件进行定性和定量分析，化合物通过与NIST 20质谱库和G.A.S.漂移时间数据库比对进行鉴定。所有分析设三个重复。
【数据】培养基：5 mL LB琼脂；培养温度：37°C；培养时间：3天；孵育温度：40°C；孵育时间：20 min；GC色谱柱：MXT-5；柱温：60°C；载气：N₂；载气流速：初始2 mL/min（10 min）→10 mL/min；IMS温度：45°C；漂移气流速：150 mL/min；重复：3次
2.7 具有抗真菌活性的单个VOC组分筛选
对单个挥发性化合物进行熏蒸抗真菌试验以筛选主要活性代谢物，对2.5节所述双皿法进行轻微修改。简言之，将商业纯VOC化合物添加到置于培养皿盖内侧的6 mm无菌滤纸片上，以达到所需最终顶空浓度（100 μL L⁻¹）。基于密封系统的有效顶空体积计算：C = Vvoc / Vheadspace，其中C代表最终蒸汽浓度（μL L⁻¹），Vvoc代表添加的挥发性化合物体积（μL），Vheadspace代表有效顶空体积（L）。黑曲霉S15在PDA上培养5天，从菌落活跃生长边缘获取均匀的6 mm菌丝饼用于接种。平板密封后28 °C培养6天，然后测量真菌菌落直径并按2.4节公式计算菌丝抑制率。初筛中完全抑制菌丝生长的化合物进行两步浓度试验。首先用10、20、40、60、80和100 μL L⁻¹系列浓度进行初步筛选以确定抑制范围，随后进行梯度细化以确定MIC。无菌蒸馏水作为对照。
【数据】滤纸片直径：6 mm；初筛浓度：100 μL L⁻¹；真菌预培养：PDA，5天；菌饼直径：6 mm；培养温度：28°C；培养时间：6天；浓度梯度：10、20、40、60、80、100 μL L⁻¹
研究结果
3.1 致病性测试
从腐烂大蒜鳞茎中分离到三株真菌（S7、S10和S15），通过两阶段接种试验按照柯赫氏法则验证其致病性（图1）。在早期侵染阶段（图1b–d），S7仅引起轻微局部变色，S10形成有限的白色菌丝，而S15迅速产生大面积黑色分生孢子病斑。延长培养后（图1f–h），毒力差异更为明显：S7和S10引起轻度组织损伤，而S15完全定殖蒜瓣，产生密集黑色孢子并导致严重组织浸软。混合感染中不同菌株间可能发生拮抗或协同互作，从而妨碍对致病机制的清晰理解；因此后续实验选择单一菌株S15作为目标病原菌。
【数据】菌株：S7、S10、S15；观察时间点：早期（第5天）和晚期（第20天）；S15表现：大面积黑色分生孢子病斑、完全定殖、严重组织浸软
3.2 菌株分离与鉴定
从半夏花中分离到内生细菌菌株H1。H1表现出与蜡样芽孢杆菌一致的形态和生化特征，包括革兰氏阳性杆状和典型菌落形态（图2a）。16S rRNA基因测序和邻接法系统发育分析鉴定H1为蜡样芽孢杆菌（GenBank登录号PQ148853）（图2c）。菌株S15在PDA上早期形成白色蓬松、径向扩展的菌落，后期因大量产孢而变黑（图2b）。ITS序列分析和MEGA 11系统发育树构建鉴定S15为黑曲霉（GenBank登录号PQ143227）（图2d）。
【数据】菌株H1：分离自半夏花，革兰氏阳性杆状，GenBank登录号PQ148853；菌株S15：GenBank登录号PQ143227；鉴定方法：16S rRNA/ITS测序+邻接法系统发育树
3.3 VOCs对病原真菌生长的影响
采用双皿培养法评估内生细菌H1对黑曲霉S15的抗真菌活性。28°C培养5天后，对照组黑曲霉菌落已覆盖整个平板。相比之下，H1 VOCs处理平板中未观察到真菌生长。这些结果表明蜡样芽孢杆菌H1产生的挥发性有机化合物（VOCs）对黑曲霉具有强效抗真菌活性。
【数据】培养温度：28°C；培养时间：5天；对照：菌落覆盖全板；处理组：无真菌生长
3.4 VOCs成分分析
采用顶空-气相色谱-离子迁移谱（HS-GC-IMS）对蜡样芽孢杆菌H1产生的VOCs进行定性分析，共鉴定出22种化合物（表1）。这些化合物涵盖广泛的化学类别，包括酮类、醛类、醇类、羧酸类、酯类以及含杂原子化合物（腈类、醚类、硫醇类）。
【数据】鉴定化合物数量：22种；化合物类别：酮、醛、醇、羧酸、酯、腈、醚、硫醇
3.5 单个VOC组分对黑曲霉S15的抗真菌活性
各单个挥发性化合物在100 μL L⁻¹体积浓度下对黑曲霉S15的抗真菌活性见表2。在测试的22种化合物中，仅乙酸和3-甲基戊酸（3-MA）完全抑制菌丝生长（菌落直径 ≤ 6 mm）。随后在降低浓度下进行浓度依赖性试验（表3）。在60 μL L⁻¹时，对照组菌落直径为64.85 ± 3.13 mm，乙酸处理组菌落直径显著降低至18.20 ± 2.12 mm；相比之下，3-MA处理组未观察到可见菌丝生长，表明在测试浓度条件下3-MA比乙酸表现出更强的抗真菌效率。通过两步梯度熏蒸试验进一步测定3-MA对黑曲霉S15的最低抑制浓度（MIC），28 °C培养6天。如图3所示，3-MA对S15的最低抑制浓度为45 μL L⁻¹。
【数据】初筛浓度：100 μL L⁻¹；有效化合物：乙酸和3-MA（菌落直径 ≤ 6 mm）；60 μL L⁻¹时对照菌落直径：64.85 ± 3.13 mm；乙酸处理组：18.20 ± 2.12 mm；3-MA处理组：无可见菌丝生长；MIC：45 μL L⁻¹；培养温度：28°C；培养时间：6天
3.6 大蒜和3-MA的广谱抗真菌效果
3-甲基戊酸（3-MA）和新鲜大蒜汁对六种病原真菌的抗真菌效果见图4。如图4A所示，3-MA（100 μL L⁻¹）处理5天后完全抑制所有六种测试真菌（Fusarium oxysporum、Colletotrichum capsici、Botrytis cinerea、Fusarium graminearum、Phytophthora capsici和Aspergillus niger S15）的菌丝生长，抑制率为100%。相比之下，新鲜大蒜汁表现出明显的菌株特异性抗真菌活性差异（图4B）。对F. oxysporum、C. capsici、B. cinerea、F. graminearum和P. capsici观察到显著抑制活性，抑制率为62.21%至82.81%，而对黑曲霉S15仅观察到极小抑制，抑制率为7.03%。这些结果表明3-MA在熏蒸条件下对测试病原菌具有广谱抗真菌活性。此外，黑曲霉S15在琼脂扩散试验中对大蒜汁表现出有限敏感性，表明该病原菌可能对大蒜来源抗菌化合物不太敏感。这些发现支持3-MA作为微生物来源熏蒸剂替代品用于控制大蒜采后贮藏期间黑曲霉的潜在应用。
【数据】3-MA浓度：100 μL L⁻¹；处理时间：5天；对6种真菌抑制率：100%；大蒜汁对5种真菌抑制率：62.21%–82.81%；大蒜汁对S15抑制率：7.03%
3.7 病原真菌扫描电镜分析
3-MA处理后黑曲霉S15的形态发生显著改变。如图5所示，未处理的菌丝表面光滑、管状结构完整（图5a1），而3-MA处理的菌丝出现皱缩和褶皱，细胞壁严重变形和破裂（图5a2）。同样，未处理的分生孢子头呈现规则的球形结构，孢子链完整（图5b1），而处理后的分生孢子头严重变形和塌陷，伴随产孢结构破坏（图5b2）。这些结果表明3-MA同时损伤黑曲霉S15的菌丝细胞壁和生殖结构。
【数据】处理组：3-MA；未处理菌丝：表面光滑、管状结构完整；处理菌丝：皱缩、褶皱、细胞壁变形破裂；未处理分生孢子头：规则球形、孢子链完整；处理分生孢子头：严重变形塌陷、产孢结构破坏
3.8 质膜完整性评估
如图6所示，PI染色显示对照组和3-MA处理组之间膜完整性存在明显差异。对照菌丝体显示可忽略的红色荧光（图6a2），表明细胞膜完整，而3-MA处理的菌丝体显示强烈红色荧光（图6a4），表明严重的膜损伤。这些结果表明3-MA破坏黑曲霉S15的质膜完整性。
【数据】对照菌丝：可忽略红色荧光（膜完整）；3-MA处理菌丝：强烈红色荧光（严重膜损伤）；染色方法：PI染色
3.9 相对电导率和pH的影响
3-甲基戊酸以浓度和时间依赖性方式显著增加黑曲霉S15的胞外相对电导率（图7A）。所有处理组的相对电导率从0至120 min稳步上升，其中2MIC组增加最为显著，120 min时达到40.33%，而对照组仅为13.92%。同时，所有处理组的培养体系pH随时间逐渐降低（图7B）；2MIC组下降最为急剧，从初始值7.48降至120 min时的6.24，而对照组在整个实验过程中维持相对稳定的pH高于6.9。这些结果表明3-甲基戊酸破坏黑曲霉S15的细胞膜完整性，增加膜通透性，促进细胞内电解质泄漏，从而提高胞外相对电导率并降低环境pH，且效果在较高浓度下更为显著。
【数据】时间：0–120 min；2MIC组120 min相对电导率：40.33%；对照组：13.92%；2MIC组pH：7.48→6.24（120 min）；对照组pH：>6.9；浓度组：MIC、2MIC等
3.10 丙二醛和麦角固醇含量测定
3-甲基戊酸诱导黑曲霉S15膜脂质过氧化，表现为MDA含量升高（图7C）。MDA含量随3-甲基戊酸浓度升高而逐渐增加，2MIC时达到未处理对照（0.0088 nmol·g⁻¹）的2.61倍（0.023 nmol·g⁻¹）。值得注意的是，1/4MIC、1/2MIC和MIC的MDA水平在统计上相当，但均显著高于对照，而2MIC组进一步显著增加。相反，麦角固醇含量……
【数据】MDA含量（对照）：0.0088 nmol·g⁻¹；MDA含量（2MIC）：0.023 nmol·g⁻¹；升高倍数：2.61倍；浓度组：1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC；原文麦角固醇部分数据未完整提供
讨论与解读
大蒜黑腐病是影响大蒜品质和价值的重大采后病害。传统防控手段包括冷藏、熏蒸和辐照，但受成本、残留问题和效果不稳定等因素限制。在此背景下，微生物挥发性有机化合物（VOCs）因可通过非接触方式抑制病原菌并在封闭贮藏系统中扩散而受到越来越多的关注。先前研究表明，芽孢杆菌来源的VOCs对多种采后病原菌（包括Botrytis、Penicillium、Monilinia和Colletotrichum）具有广谱抗真菌活性，主要通过抑制真菌生长和破坏细胞功能实现。然而，现有关于芽孢杆菌VOCs生物熏蒸的研究大多针对各种植物病原菌的病害防控，鲜有研究针对黑曲霉引起的大蒜黑腐病管理。现有针对黑曲霉引发大蒜黑霉腐病的防控研究主要集中于接触型生防制剂和抗菌材料，而特定芽孢杆菌来源挥发性化合物作为气相生防制剂的潜力鲜有探索。本研究从半夏内生蜡样芽孢杆菌H1中鉴定出3-甲基戊酸（3-MA）作为主要活性VOC，其对黑曲霉S15的MIC为45 μL L⁻¹，并通过破坏细胞壁和膜完整性、引发电解质泄漏和脂质过氧化、抑制麦角固醇合成，进而扰乱核苷酸代谢、TCA循环、脂质代谢和细胞内氧化还原稳态等多条代谢通路发挥抗真菌作用。贮藏试验表明40 μL L⁻¹以上3-MA可完全阻断大蒜黑腐病，减缓酚类和黄酮类物质下降，并激活大蒜防御酶。比较试验揭示黑曲霉S15对大蒜来源抗菌化合物敏感性有限，而3-MA在熏蒸条件下对多种植物病原菌表现出强效抗真菌活性。
编译者解读： 该研究从药用植物内生菌出发筛选挥发性抗真菌代谢物，为大蒜采后病害提供了非接触式熏蒸方案，思路值得借鉴。3-MA的MIC仅45 μL L⁻¹，且对六种病原菌抑制率达100%，展示出广谱应用潜力。但研究局限于实验室贮藏条件，实际仓储中气体扩散、吸附及残留问题尚需验证；此外，3-MA对哺乳动物的安全性数据缺失，是其产业化前必须补齐的毒理学短板。
参考来源
期刊：Postharvest Biology and Technology, 2027
DOI: 10.1016/j.postharvbio.2026.114674
DOI: 10.1016/j.postharvbio.2026.114674