来源：Tricholoma matsutake polysaccharides promote physiological germination and metabolic reactivation of Bacillus cereus spores: Mechanisms and application in milk preservation（International Journal of Food Microbiology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
芽孢杆菌属的孢子耐热性极强，是巴氏杀菌乳制品中的“定时炸弹”。本研究从松茸中提取多糖（TMP），发现1%（w/v）TMP能在2小时内将蜡样芽孢杆菌孢子的OD₆₀₀降低34%以上，效果超过L-丙氨酸、肌苷等经典萌发剂。TMP触发的是受控的生理性萌发——离子释放、结构重塑、代谢重启，却不破坏孢子膜完整性。转录组揭示479个差异基因，萌发机器、营养转运和能量代谢被显著激活。在牛奶体系中，TMP辅助温和巴氏杀菌对蜡样芽孢杆菌的抑制效果优于对照组、果糖组和L-丙氨酸/肌苷组。
研究背景
芽孢杆菌属细菌的孢子对不良环境和常规热处理具有极强抗性，持续威胁食品安全。蜡样芽孢杆菌在乳制品和罐头食品中尤为棘手——其孢子能耐受巴氏杀菌，随后在贮藏期间萌发，导致腐败或食源性疾病。孢子萌发是孢子从休眠态向代谢活跃态转变的关键生理节点，直接决定后续灭活策略的成败。因此，如何高效、特异性地诱导萌发，成为提升食品体系中孢子控制水平的核心问题。
孢子萌发由特定环境信号触发，最常见的是低分子量营养物质，如D-葡萄糖、L-丙氨酸和肌苷，它们被孢子内膜上的萌发受体识别。受体激活后，触发一系列高度有序的事件：离子释放、皮层降解、核心复水和代谢重启。然而，经典营养萌发剂（如L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-天冬酰胺和肌苷）的效果常受限于其狭窄的特异性和菌株依赖性响应，亟需寻找更广谱、更高效的萌发诱导剂。
研究方法
2.1 材料与试剂
蜡样芽孢杆菌KUST4809分离自市售罐头食品样品，保存于本实验室菌种保藏库。另选取四株产孢菌株用于跨菌株验证：枯草芽孢杆菌KUST4875（分离自豆瓣酱）、解淀粉芽孢杆菌KUST4807（分离自酱油）、赖氨酸芽孢杆菌属sp. KUST4802（分离自腐乳）和蛋白水解芽孢杆菌属sp. KUST4826（分离自泡菜）（表S1）。罗望子籽多糖和香菇多糖（来自香菇）购自源叶生物科技有限公司（中国上海）。SYTO™ 16、碘化丙啶（PI）、孔雀石绿、番红、肌苷、甘氨酸、葡萄糖、果糖、氯化钾（KCl）、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-天冬酰胺和戊二醛购自安谱实验科技股份有限公司（中国上海）。SYBR 2× RealStar FastSYBR购自GenStar（中国北京）。标准萌发缓冲液含10 mM Tris-HCl和10 mM NaCl（pH 7.4），作为无营养对照，用于评估无特定萌发剂条件下的自发萌发。Luria–Bertani（LB）培养基用于营养细胞培养，产孢则在Difco产孢培养基（DSM）中进行，该培养基广泛用于诱导高效产孢。所有溶液现配现用，经膜过滤（0.22 μm）灭菌后立即用于后续萌发实验。除非另有说明，本研究使用的所有化学品和分析试剂均为分析纯。
【数据】菌株：蜡样芽孢杆菌KUST4809、枯草芽孢杆菌KUST4875、解淀粉芽孢杆菌KUST4807、赖氨酸芽孢杆菌属sp. KUST4802、蛋白水解芽孢杆菌属sp. KUST4826；培养基：LB、DSM；缓冲液：10 mM Tris-HCl + 10 mM NaCl（pH 7.4）；过滤孔径：0.22 μm
2.2 松茸源组分的制备及TMP表征
#### 2.2.1 松茸源组分的制备
新鲜松茸子实体经清洗、切片、低温干燥后，研磨过筛获得松茸全粉（WTMP），方法参照Liang等（2025）。为获得不同松茸源组分，干燥粉末经序贯提取和分级。蛋白组分（TMPT）和膳食纤维组分（TMDF）参照已有方法略作修改制备（Qiu等，2025a；Qiu等，2025b）。TMP采用热水提取和乙醇沉淀法提取，参照已有研究略作修改（Wang等，2019；Yang和Huang，2023）。所有干燥松茸源组分溶于无菌蒸馏水，使用前新鲜配制。为比较不同松茸源组分，各溶液均配制成终浓度1%（w/v）作为标准工作液。TMP浓度依赖性实验中，TMP工作液直接从干燥TMP粉末配制，终浓度分别为0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%（w/v）。所有配制溶液经0.22 μm膜过滤灭菌，立即作为蜡样芽孢杆菌孢子萌发诱导剂用于后续实验。
【数据】浓度：1%（w/v）标准工作液；浓度梯度：0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%（w/v）；过滤孔径：0.22 μm
#### 2.2.2 TMP化学组成分析
冻干TMP溶于去离子水，浓度2 mg/mL。总多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，以D-葡萄糖为标准品。蛋白含量采用BCA蛋白检测试剂盒（源叶生物科技有限公司，中国上海）测定。
【数据】TMP浓度：2 mg/mL；总多糖检测方法：苯酚-硫酸法；蛋白检测方法：BCA法
#### 2.2.3 分子量测定
TMP分子量分布采用高效液相色谱（HPLC）系统（U3000，Thermo Scientific，美国）分析，配备示差折光检测器（RID-20 A，Shimadzu，日本）和串联凝胶渗透色谱柱（BRT105–103–101，8 × 300 mm，博睿糖，中国），方法参照Chang等（2024）略作修改。简要操作：准确称取5 mg TMP，溶于1 mL 0.2 M NaCl溶液（流动相）中，配制成5 mg/mL样品溶液。涡旋混匀后，12,000 ×g离心10 min，上清液经0.22 μm水相滤膜过滤去除颗粒杂质。最终滤液转移至进样瓶进行HPLC分析。色谱条件：流动相流速0.7 mL/min，柱温40 °C，进样量50 μL。TMP分子量分布通过将样品保留时间代入已知分子量标准品建立的校准曲线确定。
【数据】TMP用量：5 mg；溶剂：1 mL 0.2 M NaCl；样品浓度：5 mg/mL；离心：12,000 ×g、10 min；滤膜：0.22 μm；流速：0.7 mL/min；柱温：40 °C；进样量：50 μL
#### 2.2.4 TMP单糖组成分析
TMP单糖组成采用高效离子色谱系统（ICS-6000，Thermo Scientific，美国）分析，对已有方法略作修改（J. Zhou等，2023）。简要操作：10 mg TMP用2 M三氟乙酸（TFA）在120 °C水解150 min，残余TFA经氮气蒸发去除。干燥水解物用1 mL超纯水复溶，稀释十倍，12,000 ×g离心5 min。上清液在Dionex CarboPac PA20分析柱（Thermo Scientific，美国）上配备电化学检测器进行色谱分析。流动相为超纯水、100 mM NaOH和200 mM乙酸钠，流速0.5 mL/min，柱温30 °C。单糖通过与标准品保留时间比对鉴定，相对摩尔百分比通过标准校准曲线计算。
【数据】TMP用量：10 mg；水解：2 M TFA、120 °C、150 min；复溶：1 mL超纯水；稀释：10倍；离心：12,000 ×g、5 min；流动相：超纯水、100 mM NaOH、200 mM乙酸钠；流速：0.5 mL/min；柱温：30 °C
2.3 菌株和孢子悬液制备
所有测试产孢菌株（包括蜡样芽孢杆菌KUST4809、枯草芽孢杆菌KUST4875、解淀粉芽孢杆菌KUST4807、赖氨酸芽孢杆菌属sp. KUST4802和蛋白水解芽孢杆菌属sp. KUST4826）的营养细胞常规在LB培养基中37 °C、180 rpm振荡培养12 h。LB过夜培养物以5%接种量接种至DSM，该接种量广泛用于促进高效产孢（Kamboyi等，2024）。各菌株孢子悬液通过在DSM中诱导产孢96 h制备，随后按Ankolekar和Labbé（2010）所述方法经蔗糖密度梯度离心收获、洗涤和纯化。简要操作：产孢培养物收获后用无菌蒸馏水洗涤，4 °C、5000 ×g离心30 min。孢子沉淀在相同条件下洗涤三次，去除残余营养细胞和碎片。孢子纯度和形态经孔雀石绿染色验证。仅使用以相亮孢子为主且无明显营养细胞污染的孢子悬液进行后续实验。制备孢子的萌发响应性通过在实验条件下监测暴露于萌发剂后OD₆₀₀下降来验证。纯化孢子重悬于无菌水，调整至终浓度1.5 × 10⁸ CFU/mL。孢子悬液4 °C保存，72 h内使用，以确保后续实验中的稳定性和萌发响应性。
【数据】培养条件：LB、37 °C、180 rpm、12 h；接种量：5%；产孢：DSM、96 h；离心：4 °C、5000 ×g、30 min；孢子浓度：1.5 × 10⁸ CFU/mL；保存：4 °C、72 h内使用
2.4 孢子萌发评估
#### 2.4.1 TMP及其他萌发剂诱导的跨菌株孢子萌发评估
孢子萌发通过监测600 nm光密度（OD₆₀₀）变化评估，这是孢子核心水化和萌发过程中结构转变的经典间接指标（Tehri等，2018）。多菌株孢子悬液调整至约10⁸ CFU/mL，在含本实验所用萌发剂的25 mM Tris-HCl缓冲液中孵育。所有萌发溶液使用前检查pH并维持pH 7.4，确保所有处理在相同pH条件下进行。
【数据】检测指标：OD₆₀₀；孢子浓度：约10⁸ CFU/mL；缓冲液：25 mM Tris-HCl；pH：7.4
研究结果
3.1 TMP的化学表征
TMP的化学组成、单糖组成和分子量分布总结于表1，分子量分布和单糖组成的代表性色谱图见图S1和图S2。TMP总多糖含量为78.2%（w/w），表明多糖是提取组分的主要成分。同时检测到少量蛋白，占6.3%（w/w），说明热水提取和乙醇沉淀过程有效富集了多糖组分，仅保留了有限的蛋白杂质。单糖组成分析显示，TMP主要由葡萄糖和半乳糖组成，相对摩尔百分比分别为61.3%和22.1%。甘露糖也作为次要但显著的组分被检出，占9.0%。此外，岩藻糖、半乳糖醛酸和木糖以较低比例存在，分别占4.0%、1.9%和1.7%。这些结果表明TMP是一种以葡萄糖和半乳糖残基为主的杂多糖。半乳糖醛酸的存在进一步提示TMP含有少量酸性糖残基，这可能有助于其理化性质和潜在生物活性。分子量分布分析显示，TMP的重均分子量（Mw）为38,704 Da，数均分子量（Mn）为37,879 Da。Mw和Mn数值接近，表明分子量分布相对较窄。总体而言，TMP被表征为一种富含葡萄糖和半乳糖的杂多糖，具有中等分子量和较高的多糖纯度。这些结构特征为后续评估其在孢子萌发诱导中的作用提供了化学基础。
【数据】总多糖含量：78.2%（w/w）；蛋白含量：6.3%（w/w）；单糖组成：葡萄糖61.3%、半乳糖22.1%、甘露糖9.0%、岩藻糖4.0%、半乳糖醛酸1.9%、木糖1.7%；Mw：38,704 Da；Mn：37,879 Da
3.2 TMP显著加速蜡样芽孢杆菌孢子的生理性萌发
#### 3.2.1 TMP的比较萌发活性和菌株特异性
为鉴定蜡样芽孢杆菌孢子萌发的有效触发因子，首先将WTMP与经典营养型萌发剂（包括KCl、L-缬氨酸、甘氨酸、L-天冬酰胺、肌苷和L-丙氨酸）以及单糖（葡萄糖和果糖）进行比较。孢子萌发通过监测振荡条件（37 °C，180 rpm）下孵育2 h后600 nm光密度（OD₆₀₀）的下降进行定量评估。如广泛确立的那样，早期萌发过程中孢子折光性的丧失和随后的核心水化导致OD₆₀₀显著下降；因此，OD₆₀₀下降幅度越大反映萌发越强（Setlow，2014a；Yi和Setlow，2010）。如图1A所示，与未处理对照相比，所有测试的营养萌发剂和单糖均诱导OD₆₀₀显著下降，表明蜡样芽孢杆菌孢子萌发成功启动。其中，WTMP诱导的OD₆₀₀下降最为显著，显著大于所有其他处理（p < 0.05）。经典营养萌发剂（包括肌苷和氨基酸）表现出中等效果，而葡萄糖和果糖导致的OD₆₀₀下降相对较弱。这些结果表明，在相同条件下，WTMP比经典营养萌发剂和代表性单糖更有效地促进孢子萌发。
基于上述结果，在相同条件下评估了松茸源组分（包括TMP、TMDF和TMPT）的萌发诱导活性（图1B）。与未处理对照组（Ctrol）相比，所有组分均诱导不同程度的OD₆₀₀下降，表明萌发成功启动。TMPT和TMDF处理导致OD₆₀₀中度下降，两组间无显著差异（p > 0.05），表明其萌发促进活性有限。相比之下，WTMP导致更显著的OD₆₀₀下降，反映萌发效率增强。值得注意的是，TMP表现出最强的萌发促进效果，其OD₆₀₀值为所有处理中最低（p < 0.05），表明松茸的萌发诱导活性主要与其多糖组分相关。
为进一步评估TMP的功效，将其萌发诱导能力与其他天然多糖（罗望子籽多糖和香菇多糖）进行比较。如图1C所示，所有多糖处理均显著增强萌发（相对于对照，p < 0.05），表明天然多糖可促进蜡样芽孢杆菌孢子萌发。然而，TMP诱导的OD₆₀₀下降显著大于两种对照多糖（p < 0.05），而罗望子籽多糖和香菇多糖之间无显著差异（p > 0.05）。这些结果进一步表明，多糖诱导的萌发可达到与经典营养萌发剂相当或更强的响应，其机制可能整合了多种物理化学和结构线索，而非仅依赖特定的受体介导识别（Moir，2006）。
最后，通过将孢子与0.25%至2.5%（w/v）浓度的TMP孵育2 h，进一步研究TMP对萌发的浓度依赖性效应（图1D）。由于较低的OD₆₀₀值表示较强的萌发，1% TMP显示出最强的OD₆₀₀响应。OD₆₀₀下降和萌发率均随TMP浓度增加而逐渐升高，呈现明显的浓度依赖性趋势，在1%（w/v）时达到最大，被确定为萌发诱导的最佳浓度。浓度高于1%时未观察到进一步增强，表明萌发诱导效应饱和。这些结果证实1% TMP是促进蜡样芽孢杆菌孢子萌发的最有效浓度，为其在后续比较分析中的应用提供了依据。较高TMP浓度下萌发降低可能源于浓度依赖性物理化学效应，如粘度增加、大分子聚集或孢子微环境改变，限制了有效的TMP-孢子相互作用。需要指出的是，经典营养萌发剂在文献推荐的最佳浓度下测试，其他松茸源组分在1%（w/v）下测试，因此未评估这些处理在更高浓度下是否也存在类似的抑制关系。
为进一步确定TMP的萌发促进效应是否仅限于蜡样芽孢杆菌KUST4809，还是可扩展至其他食品相关产孢菌株，在相同处理条件下评估了不同萌发菌株对TMP的响应（图1E）。无TMP时，所有测试菌株维持相对较高的OD₆₀₀值，表明对照组中自发萌发有限。相比之下，TMP处理显著降低了所有测试菌株的OD₆₀₀值，包括蜡样芽孢杆菌KUST4809、枯草芽孢杆菌KUST4875、解淀粉芽孢杆菌4807、蛋白水解芽孢杆菌属sp. KUST4826和赖氨酸芽孢杆菌属sp. KUST4802。这些结果表明TMP诱导的萌发并非蜡样芽孢杆菌独有，而是在多种产孢细菌中表现出更广泛的刺激效应。然而，TMP诱导的OD₆₀₀下降幅度因菌株而异，表明对TMP的响应具有菌株依赖性。在测试菌株中，蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌表现出相对较强的响应，而赖氨酸芽孢杆菌属sp. KUST4802表现出相对较弱但仍显著的响应。这种变异性可能与孢子表面结构、皮层结构、膜通透性或萌发相关受体的差异有关。
【数据】孵育条件：37 °C、180 rpm、2 h；TMP最佳浓度：1%（w/v）；OD₆₀₀下降：>34%（2 h内）；浓度范围：0.25%-2.5%（w/v）；统计学显著性：p < 0.05
讨论与解读
本研究鉴定TMP为蜡样芽孢杆菌孢子萌发的有效非经典诱导剂。TMP触发受控且生理协调的萌发过程，其特征是膜通透性、离子释放、结构重塑和代谢重启的协同激活，且不损害孢子完整性。在分子层面，TMP诱导广泛的转录重编程，优先支持能量生产和萌发特异性功能，而非生物合成前体合成，反映了支持快速脱离休眠的战略性代谢转变。该方法的实际潜力在牛奶模型中得到验证——TMP诱导的萌发通过抑制处理后生长显著增强了温和巴氏杀菌的效果，优于传统营养萌发剂。这些发现确立了多糖作为孢子生理功能调节剂的地位，并将TMP辅助萌发定位为改善巴氏杀菌乳制品微生物安全的有前景的天然策略。未来工作应聚焦于阐明TMP萌发诱导活性的构效关系及复杂食品基质中的表现，以促进其在食品保鲜中的更广泛应用。然而，鉴于TMP是复杂的富含多糖的混合物，其对非目标微生物（包括有益肠道菌群和乳品发酵剂）的潜在影响应予以关注。
编译者解读
该研究的巧妙之处在于“以子之矛攻子之盾”——利用天然多糖诱导孢子提前萌发，使其丧失耐热性后再行温和杀菌。TMP作为松茸来源的天然产物，兼具安全性和广谱性，1%浓度即可超越经典萌发剂，且不引起孢子膜损伤，避免了萌发后增殖的风险。但TMP是复杂混合物，其构效关系尚未阐明，批次间一致性也是产业化难点。此外，对乳品发酵剂的潜在影响值得进一步评估。
参考来源
期刊：International Journal of Food Microbiology, 2026
DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2026.111936
DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2026.111936