来源：噬菌体展示淘选回收弱宿主菌株选择（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
淘选做到第三轮，洗脱液滴度还是上不去？弱宿主菌株回收率低，别急着重做文库。问题常卡在宿主菌状态、洗脱中和、扩增偏倚这三处。本文从低级错误到进阶疑难，按淘选前、结合洗涤、回收感染、滴度验证拆开讲，给你能直接上手的参数和判断动作。
第一步：快速排查低级错误
- 宿主菌OD600不在0.3-0.5：重新接菌到OD600 0.4，37°C、220 rpm培养后再用。
- F'菌毛丢了：用-80°C甘油菌新划板，挑单克隆接2×YT，别用4°C放3天的平板。
- 洗脱液没中和：洗脱后立即加1 M Tris-HCl pH 8.0至终浓度0.1 M，冰上操作。
- 输入噬菌体量记错：每轮留输入、洗脱、扩增样品，按10倍系列稀释，取100 µL铺板计数。
第二步：分维度系统排查
1. 淘选前：弱宿主菌株选错或状态不对
现象：洗脱液滴度低于1×10^4 TU/mL，扩增后也起不来。原理：弱宿主菌株的F'菌毛表达低、生长慢，感染效率本来就低，状态再偏就只剩背景。解决：选低扩增偏倚宿主，从甘油菌划板，单克隆接2×YT，37°C、220 rpm到OD600 0.35-0.45；弱宿主感染时按1:20体积比加噬菌体，37°C静置30 min，再220 rpm 45 min。验证：同时测输入噬菌体滴度和洗脱滴度，回收率=洗脱滴度/输入滴度，低于1×10^-6先查宿主状态。
2. 结合与洗涤：弱结合克隆被洗没
现象：第一轮有信号，第二轮掉到背景。原理：弱结合噬菌体解离快，洗涤体积大、次数多、Tween-20高就丢失。解决：洗涤用PBS+0.1% Tween-20，第一轮3次、每次1 mL，第二轮5次，每步孵育10 min，4°C或冰上操作。验证：留洗涤液测滴度，若洗涤液滴度接近洗脱液，说明洗过头。
3. 洗脱：pH没中和或洗脱不充分
现象：洗脱液滴度低，中和后仍低。原理：0.2 M甘氨酸-HCl pH 2.2洗脱，弱宿主膜更脆，残留酸会杀死感染菌。解决：加100 µL洗脱液后室温10 min，立即加1 M Tris-HCl pH 8.0 15 µL中和到pH 7.0-7.5；用pH纸点样确认。验证：取5