来源：核酸扩增抑制物残留柱纯化二次处理（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
qPCR 反复出现 Ct 偏大、曲线起不来、内参正常而目的基因异常，一稀释样本就“复活”？大概率是抑制物没清干净。一次柱纯化后仍有残留，二次过柱又丢样，是分子实验室最常见的卡点之一。本文从低级错误、上柱结合、洗涤洗脱到二次柱前处理，给你一条能直接照着做的排查路径。
第一步：快速排查低级错误
1. Wash Buffer 没加无水乙醇。 瓶身写“25 mL 浓缩液加 75 mL 无水乙醇”，就按这个加；别用 95% 乙醇替代后又少加。解决：整瓶重配，标记日期和“已加乙醇”。
2. 二次柱前把一次洗脱液直接上柱。 洗脱液是低盐，DNA 根本不结合。解决：先加 5 倍体积含胍盐结合液，按说明书必要时补 1 倍体积无水乙醇，混匀后再上柱。
3. 省略空转干燥。 洗涤后直接洗脱，乙醇和盐一起下来。解决：12,000×g 空转 2 min，开盖 37°C 放 3–5 min，别超过 10 min。
4. 上柱量过载或移液碰到膜。 每柱总核酸控制在 ≤10 µg，每次上柱 ≤700 µL；枪头别戳 silica 膜。解决：超量分两柱，洗脱液 12,000×g 1 min 后再取。
第二步：分维度系统排查
1. 样本盐浓度和 pH 不合适。
现象：二次柱得率低，洗脱液电导偏高，qPCR 1:5 稀释后 Ct 明显下降。
原理：高盐、极端 pH 会削弱核酸与硅胶膜结合，抑制剂也更容易共洗脱。
解决：先测电导，>5 mS/cm 用 TE 稀释 2–5 倍；pH 低于 7 时补 10 mM Tris-HCl pH 8.0。上柱前加 0.1 倍体积 3 M NaAc pH 5.2 和 2.5 倍体积无水乙醇，-20°C 放 10 min。
验证