来源：质粒定点突变效率低引物磷酸化（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做定点突变，菌落少、测序全是模板、平板只有星星点点几个克隆，这种崩溃感你懂。问题常不在“手气”，而在引物磷酸化、模板残留、PCR循环和连接转化这几步。下面按“先查低级错，再按流程拆，最后处理疑难”的顺序，把质粒定点突变效率低的原因和验证动作一次讲清，尤其把引物磷酸化这个高频坑掰开说。
第一步：快速排查低级错误
1. 引物订单没勾5'磷酸化，或只磷酸化了一条。解决：翻合成报告，确认两条引