来源：流式样本粘连双峰涡旋分散参数（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
上机跑了半小时，FSC-A/FSC-H 图上斜着拉出一条线，或者干脆冒出个双峰。第一反应是加大涡旋？先停一下。过度涡旋会把细胞打碎、把 DNA 放出来，越旋越粘。这篇从解离、离心、重悬浓度，到涡旋档位、时间、体积，把粘连双峰的排查路径一次讲完，参数都给到具体数值。
第一步：先花3分钟排掉低级错误
1. 管子没夹稳。涡旋头只蹭管壁不碰管底，液体在管里打转，细胞根本没散开。解决：掌心压住管底，让涡旋头垂直压进去，看到液面形成完整漩涡再计时。
2. 上机浓度太高。超过 1×10⁷/mL，鞘液稀释不过来。解决：用含 0.5% BSA 的 PBS 稀释到 2-5×10⁶/mL，冰上放。
3. 涡旋完马上上机。气泡和刚打散的团块还没沉降。解决：冰上静置 60 秒，开盖前轻弹管壁。
4. 滤网用错。100 μm 滤网放过小团块。解决：40 μm 细胞滤网过一遍，别拿注射器活塞硬压。
第二步：按流程分维度系统排查
1. 解离与消化：团块的源头
现象：上机前肉眼可见絮状物，FSC 低区拖尾。原理：胶原酶消化过头，细胞膜破裂释放 DNA，DNA 像网一样把细胞粘成串。解决：胶原酶 IV 1 mg/mL，37°C 15-20 分钟，每 5 分钟吹打 5 次；终止加等体积含 10% FBS 的 PBS；补 DNase I 10 U/mL 室温 5 分钟。验证：取 10 μL 悬液加台盼蓝，镜检下每视野团块少于 3 个。
2. 离心与弃上清
现象：重悬后泡沫多，细胞成片。残留培养基里的蛋白和死细胞碎片在捣乱。300 g、4°C 离心 5 分钟，弃上清留约 50 μL，别倒扣。用 1 mL 移液器低档吹打 10 次，别用涡旋代替吹打。
3. 重悬体积与管子匹配
现象：同样转速，1.5 mL 管里装 1 mL 就是不散。涡旋能量跟液体体积直接相关。200-500 μL 装在 1.5 mL EP 管里，涡旋效率最高；超过 1 mL 换 15 mL 管配大涡旋头。验证：涡旋后立刻取 5 μL 滴在载玻片，10× 镜下一个视野内细胞团不超过 2 个。
4. 涡旋参数：档位、时间、脉冲
现象：涡旋 30 秒后双峰没消失，碎片峰反而涨了。原理：连续涡旋产生剪切力，细胞膜先破。解决：桌面涡旋仪中档（约 2500 rpm），10 秒×2 次，中间冰上停 5 秒；管盖用 Parafilm 封一圈，防气溶胶。细胞浓度高时加到 3 次，总时长别超 45 秒。验证：涡旋前后各取 100 μL 上机，看 FSC-SSC 图上碎片比例变化小于 5%。
5. 固定与染色
现象：染色后过夜，双峰更明显。PFA 交联蛋白，细胞间粘附增多。解决：1% PFA 4°C 固定 15 分钟就上机，别过夜；必须过夜时加 0.1% BSA+2 mM EDTA，4°C 避光。验证：固定后 40 μm 滤网再过一次。
6. 上机采集与去粘连门
现象：图上斜线，双峰。原理：两个细胞同时通过激光，FSC-A 翻倍而 FSC-H 不变。解决：流速设低档（1-2 档，<500 events/s），样本压力≤5 psi；先跑 FSC-A vs FSC-H 画单细胞门，再跑 FSC-H vs FSC-W。采集 10000 个单细胞事件，不是 10000 总事件。验证：去粘连门后单细胞比例大于 95%。
第三步：进阶疑难，别把所有双峰都当粘连
1. **真双