来源：细胞支原体污染隐蔽PCR检测方法（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
细胞看着透亮、传代也正常，一做支原体PCR却报阴性。别急着庆祝。这项检测的失败点全在细节里：取样只取上清、模板里带着SDS、退火温度高了2°C，任何一个都能把阳性做成阴性。反过来，气溶胶里飘进一个扩增产物，阴性也能变阳性。下面按取样、制模板、配体系、看结果四个环节逐个拆解，给出具体体积、时间和温度，照做就能定位问题出在哪一环。
第一步：先排除新手最常犯的基础错误
1. 只取培养上清，不取细胞。支原体贴在细胞膜上，上清里的量可能只有细胞的十分之一。解决：上清和细胞各取一份，分开检测。
2. 模板加太多。裂解液里残留的SDS、蛋白酶K会直接抑制Taq酶活性。解决：煮沸法模板每次只加2 µL，25 µL体系里不超过1/10体积。
3. 忘了设阳性对照。跑完胶看不到条带，你不知道是样本阴性还是体系失效。解决：每批必带10 pg/µL的M. orale基因组DNA。
4. 引物反复冻融。工作液浓度掉到一半以下，弱阳性直接漏检。解决：10 µM分装成20 µL一支，-20°C保存，用一支扔一支。
第二步：分维度系统排查
A. 取样环节
1. 现象：同一批细胞，上清检测阴性，细胞沉淀检测阳性。
原理：M. hyorhinis这类种属主要结合在细胞表面，上清里游离的量很低。你只取1 mL上清直接煮，等于把灵敏度打了个骨折。
解决：贴壁细胞用胰酶消化或细胞刮收集，PBS洗一次；上清单独取1 mL，300 g离心5 min去细胞，再12,000 g、4°C离心10 min，沉淀用50 µL PBS重悬。两份都做。
验证：两份同时上机，只有沉淀出带，说明后续取样一律改成“上清+细胞”双份。
2. 现象：细胞传了很多代才检出，早期几次全是阴性。
原理：污染初期载量常在10² copies/mL以下，低于普通PCR的检出限。
解决：加大取样量，上清取5-10 mL离心富集；或者把细胞传两代、密度养到80%再取。