来源：膜蛋白提取效率低去垢剂组合（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
膜蛋白提取中最令人头疼的地方在于：细胞培养良好，裂解顺利，但 Western blot 结果中的目标条带却非常淡。九成以上的问题出在去垢剂体系和膜回收这两步，而不是抗体。下面按实验流程，从细胞破碎、膜回收、去垢剂选择一直讲到缓冲液条件，每一步都给出可执行参数和验证动作。照着走一遍，大概率能定位到问题出在哪一步。别急着换抗体，也别急着买新去垢剂。
第一步：先快速排除低级错误
下面几个错误新手常犯，耽误的时间却最多。
1. PMSF 没有现配现加。 PMSF 在水溶液中的半衰期只有 30–60 分钟，必须在裂解前加入，使其终浓度达到 1 mM，现象是条带下方出现弥散降解带。现配现用，不要从 4°C 的旧管中直接吸取。
2. 去垢剂母液没有完全溶解。 10%（w/v）DDM 母液在 4°C 会析出结晶。用前放到 37°C 水浴中加热 10 分钟，直到澄清，别用涡旋振荡，气泡会让浓度不准。
3. 超速离心这一步被跳过。 只用 14,000 rpm 的常规台式离心机，膜碎片无法沉淀，会留在上清中被你一并倒掉。膜沉淀必须用 100,000 × g、4°C 离心 1 小时。
4. 只跑上清，不留下沉淀。 全裂解液、上清、沉淀三份都要留样。少了哪一份，你就无法判断蛋白到底在哪一步丢失。
第二步：按实验流程分模块系统排查
1. 破碎与膜回收不彻底
现象：全裂解液跑胶有明显的条带，但上清中几乎没有，沉淀中的条带很深。
原理：膜蛋白没有进入可溶相，问题出在裂解或离心强度。超声能量不足时，细胞仍完整；离心力不够时，膜小泡悬浮在上清中，看似“提取失败”。
解决：裂解液中含 1 mg/mL 溶菌酶，冰上 30 分钟；超声 3 s on / 3 s off，20% 振幅，共 30 次循环，全程冰浴。缓冲液配方为 20 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM EDTA、10% 甘油、1 mM PMSF 和 1× 蛋白酶抑制剂。收集膜后，用含 0.1 M Na₂CO₃ pH 11.5 的缓冲液冰上洗 30 分钟，再 100,000 × g 离心 30 分钟；这一步可剥离外周蛋白，能显著提高后续去垢剂溶解膜蛋白的选择性。
验证：三份样品分别用 BCA 法定量后等量上样，看清条带分布。
2. 去垢剂浓度低于 CMC
现象：膜沉淀存在，加了去垢剂后仍然浑浊，跑胶看不到目标条带。
原理：去垢剂在 CMC 以下只以单体形式存在，不形成胶束，根本溶不了脂双层。DDM 的 CMC 约为 0.0087%（w/v），常用工作浓度 1% 相当于 100 倍以上 CMC；CHAPS 的 CMC 约为 0.046%，工作浓度一般用 1%（约 16 mM）；Triton X-100 的 CMC 约为 0.015%；OG 的 CMC 约为 0.023%，工作浓度要 1–1.5%。用 OG 时更要小心：透析稀释到 CMC 以下，蛋白立刻沉淀。
解决：工作浓度按 10–20 倍 CMC 起步。DDM 用 1%，LMNG 用 0.5%，CHAPS 用 1%，Triton X-100 用 1%。不确定时做梯度：0.1%、0.5%、1%、2% 四个点平行小试。
验证：取溶解后的样品 100,000 × g 离心 1 小时，上清跑 SDS-PAGE，比较各浓度下目标条带的强度。
3. 蛋白与去垢剂比例失衡
现象：样品浓度越做越高，反而越提不出来，溶液发黏、浑浊。
原理：膜蛋白与去垢剂的质量比通常要落在 1:2 到 1:10 之间。膜浓度过高时，去垢剂会被大量脂质消耗，有效浓度跌破 CMC。
解决：膜悬液的蛋白浓度控制在 2–5 mg/mL；DDM 终浓度 1%（即 10 mg/mL），比例约 1:3–1:5。脑组织、线粒体这类富脂样品加到 1.5–2%。超过 5 mg/mL 时所有比例都得重新计算。
验证：定量前先做去垢剂兼容性测试。Triton 和 DDM 对 BCA 法有干扰，读数虚高，改用 Bradford 法或 Amido Black 法。
4. 缓冲液条件不匹配
现象：同类样品，有的批次提得出，有的批次提不出。
原理：pH 影响膜蛋白的等电点与去垢剂聚集行为；盐浓度影响静电屏蔽；Mg²⁺、Ca²⁺ 会促使膜碎片聚集，把目标蛋白一起拖进沉淀。
解决：20 mM HEPES pH 7.4 或 Tris-HCl pH 7.5，150–300 mM NaCl，10% 甘油，1 mM EDTA，不加二价阳离子。pH 拿不准就平行试 6.5、7.5、8.5 三个点，每管 200 µL 小体系，成本很低。
验证：三管同时跑胶，看哪一管上清条带最深。
5. 温度与孵育时间
现象：4°C 过夜孵育后，提取率明显低于预期。
原理：低温降低脂质流动性，DDM 在 4°C 的溶解度也会下降。部分去垢剂浊点低，温度稍高就分相。
解决：常规体系 4°C 旋转孵育 1–2 小时即可，别过夜。