来源：蛋白降解过快蛋白酶体抑制策略（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做重组蛋白表达纯化，最崩溃的不是不表达，而是表达了又没了。诱导前有条带，收样后只剩影子。你补了MG132，换了裂解液，条带还是弱。问题大概率不在抗体，而在降解没拦住。这篇教程按实验流程拆开讲：从培养诱导到裂解纯化，再到检测，逐段排查蛋白降解的原因，给出可直接上手的抑制剂浓度、操作温度和验证动作，兼顾蛋白酶体与溶酶体两条通路。
第一步：快速排查低级错误
这几个错，新手一天能犯三次。
1. 裂解液里没加抑制剂，或者临用才补。细胞一裂，蛋白酶体全放出来。解决：裂解液现配，MG132加到终浓度20 μM，PMSF 1 mM，全程冰上操作。
2. 样品反复冻融。冻一次，降解一批。解决：收样后立刻分装20 μL小管，-80°C保存，用完即弃，冻融别超2次。
3. 上样缓冲液煮太久。95°C、5分钟就够。煮20分钟，小分子蛋白直接断给你看。解决：定时器设5分钟，沸水浴或PCR仪都行。
4. 血清饥饿过夜还不补抑制剂。血清饥饿24 h会激活自噬和蛋白酶体。解决：饥饿别超6 h，或者转染前4 h换无血清培养基，收了就处理。
第二步：分维度系统排查
按实验顺序来。哪一步丢的蛋白，就在哪一步找。
1. 诱导表达阶段：蛋白在细胞里就被清了
现象：诱导后取全蛋白跑胶，目标带比预期弱很多，或者出现弥散的降解条带。
原理：新生蛋白折叠不好，泛素连接酶贴上K48泛素链，26S蛋白酶体直接降解。哺乳细胞、酵母、昆虫细胞都有这套系统，而且很活跃。
怎么判断：做一组对照。诱导后加MG132至20 μM，37°C孵育4-6 h，再收样。加药组条带明显变深，就是蛋白酶体在清。
怎么解决：哺乳细胞用MG132 10-50 μM，处理4-8 h。毒性大，别超过12 h。想要低毒，换bortezomib 100 nM-1 μM。酵母用MG132 50 μM。同时把诱导温度降到25-30°C，诱导时间压到4-6 h，减少错误折叠蛋白堆积。N端挂SUMO或MBP标签，也能挡一挡降解。
验证方法：加药组和不加药组，同一时间点收样，SDS-PAGE跑10%胶，考马斯亮蓝染色，看目的带灰度差。
2. 裂解提取阶段：抑制剂加晚了
现象：裂解液上清里目的蛋白少，低分子量杂带多。
原理：裂解破坏区室化，蛋白酶体和溶酶体酶一起释放。4°C能减速，但拦不住酶活。
怎么判断：同一批细胞，一半用含抑制剂裂解液，一半用PBS裂解。冰上放30 min后跑胶。有抑制剂的那份带更深，就是降解。
怎么解决：裂解液现配现用。配方给你：50 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl，1% NP-40，加1 mM PMSF、1 μg/mL leupeptin、1 μg/mL pepstatin A、1 mM EDTA，再加MG132 20 μM。超声时冰浴，每次5 s、间歇10 s，总时长别超2 min。
验证方法：裂解后0 h和2 h各取一份，加2×上样缓冲液煮5 min冻存。跑胶比较，2 h那份带明显弱，就是没拦住。
3. 纯化阶段：室温待太久
现象：亲和柱洗脱峰小，或者洗脱液放一晚就降解。
原理：纯化过程换了缓冲液，保护蛋白没了，加上室温操作，蛋白酶活性回升。
怎么判断：纯化每一步取10 μL留样，跑胶看哪一步丢。
怎么解决：全程4°C冷室操作。缓冲液加10%甘油、0.1% Tween-20稳定蛋白，pH调到