来源：无细胞表达产量低能源再生系统（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
做无细胞表达，最让人崩溃的不是没信号，而是前2小时曲线漂亮，4小时后一头栽下来。上清里跑不到目标带，产量卡在300 µg/mL上不去。大部分人都去怀疑模板和裂解物，结果折腾一圈才发现，是能源再生系统提前断供了。这篇教程按排查顺序拆开讲：低级错误、能量底物、再生酶、镁离子、pH、辅因子、反应器规模，每一环都给判断方法和具体参数。你照着走一遍，大概率能找到断点。
第一步：先别动配方，查这4个低级错误
1. 磷酸肌酸称错量级。 终浓度要33 mM，有人拿10×储液稀释两次算成了3.3 mM，前1小时能出蛋白，后面直接停。重新称重、核对储液浓度，反应前现配现用。
2. 模板加太多，体积超了。 质粒模板一般10–20 nM，PCR产物3–5 nM。加入体积超过总反应体积20%，Mg²⁺和K⁺被稀释，翻译效率掉一半。模板储液浓缩到200–500 ng/µL再点。
3. 37°C孵育还过夜。 无细胞体系的能量储备撑不过6小时，37°C下消耗更快，2–3小时后ATP就掉到0.1 mM以下，接着是蛋白酶降解产物。改30°C、4小时，或者30°C、6小时。
4. 裂解物反复冻融。 S30裂解物每冻融一次，内源酶活掉10–20%。分装成20 µL一管，-80°C，用一管取一管。
第二步：按流程分模块系统排查
1. 能量底物自己先坏了
现象： 1小时取样有带，3小时取样变淡，6小时几乎没有新增。总产量200–400 µg/mL，正常批次能到800–1500 µg/mL。
原理： 磷酸肌酸在水溶液里自发水解，4°C半衰期只有1–2天。PEP更不稳定，冻融一次就损失明显。底物浓度不够，肌酸激酶再强也救不回来。
解决： 磷酸肌酸配成1 M储液，-80°C分装成50 µL，用前冰上化开，每次只解冻一份。终浓度33 mM。怕水解就换3-磷酸甘油酸（3-PGA），终浓度30–40 mM，稳定性好一截。
验证： 做时间点曲线，1、2、3、4、6小时各取5 µL，跑SDS-PAGE或测荧光。如果2小时就饱和、后面不涨，基本是底物损失。
2. 再生酶失活了
现象： 补加磷酸肌酸也没用，ATP在30分钟内从1.2 mM掉到0.1 mM以下。
原理： 肌酸激酶（CK）和丙酮酸激酶（PK）都不耐反复冻融，也不耐高浓度Mg²⁺。提前混进裂解物里预孵育，活性掉得更快。
解决： CK按250 µg/mL、PK按20–50 µg/mL，临用前从-20°C取出直接加进反应液，别提前配混合液。用PEP/PK系统时，PEP终浓度20–30 mM。
验证： 用ATP荧光检测试剂盒，反应0、30、60、120分钟各取2 µL测。ATP曲线正常应该是缓慢下降，不是断崖。
3. Mg²⁺和NTP比例失衡
现象： 产量低但曲线形状正常，或者加氨基酸混合物后立刻出现白色沉淀。
原理： Mg²⁺要和ATP、GTP、PEP、磷酸根配平。Mg²⁺不足，形不成Mg-ATP复合物，翻译起不来；Mg²⁺过量，模板沉淀、翻译被抑制。这两个方向都会压低产量，但表现完全不一样。
解决： 固定其他条件，做Mg-谷氨酸梯度：8、10、12、14、16、18、20 mM。磷酸肌酸体系最优常在12 mM左右，3-PGA体系常要16–20 mM。别用MgCl₂，氯离子抑制翻译。
验证： 96孔板做15 µL小体系，每个梯度3个复孔，30°C 4小时，测GFP荧光或跑胶定量。曲线顶点就是该体系的最优Mg²⁺。
4. pH漂移和副产物堆积
现象： 反应液从淡红变黄（加了酚红的话），产量在3小时后骤停。
原理： PEP分解产生丙酮酸和游离磷酸，糖酵解产乳酸，pH一路往下掉。磷酸盐累积到30–50 mM就明显抑制翻译。PURE体系里这个问题更突出，因为缓冲能力更弱。
解决： 缓冲液用50 mM Hepes pH 7.5，别用磷酸盐缓冲液。加10 mM谷氨酸钾平衡离子。PEP体系可加苹果酸或3-PGA替代部分PEP，减少磷酸释放。
验证： 反应前后用微电极测pH，或者用pH试纸点一下。测终点游离磷酸浓度，超过40 mM就要改配方。
5. 氧化还原和辅因子跟不上
现象： 表达含二硫键的蛋白，或者用NAD⁺依赖的糖酵解供能体系，产量直接腰斩。
原理： DTT/TCEP维持还原环境，但糖酵解通路需要NAD⁺再生，靠丙酮酸还原成乳酸来补。NAD⁺不够，糖酵解供能就断。
解决： DTT 1–2 mM或TCEP 1 mM；用葡萄糖供能时加NAD⁺ 1 mM；含二硫键的蛋白改用谷胱甘肽还原型/氧化型4:1的氧化还原缓冲。
验证： 非还原SDS-PAGE看有没有多聚体，同时测反应液中NADH/NAD⁺比值。
6. 放大后传质变差
现象： 15 µL小体系能到1000 µg/mL，放大到500 µL或1 mL掉到300 µg/mL。
原理： 大体积氧传质差，底物扩散受限，副产物在局部堆积。批式反应越放大越吃亏。
解决： 用10 kDa MWCO透析膜，对着底物室补能量；或者上连续流。大体积反应瓶加0.1% Tween-20，摇床200 rpm，30°C。小体积就在1.5 mL管里摇。
验证： 同一批裂解物，同时做15 µL和500 µL对照，看产量差多少。差2倍以上就是传质问题。
第三步：进阶疑难
裂解物批次差异。 换一批S30，配方没变，产量从1200掉到400。不同批次的内源糖酵解酶和代谢物差2–3倍，这很常见。每批新裂解物做一次Mg²⁺、温度和能量底物的小矩阵，找到它的最优点。想彻底摆脱批次问题，换PURE体系，成分确定，但PURE对能量底物更敏感，磷酸肌酸33 mM、Mg²⁺ 10–12 mM是常用起点。
能量再生和氨基酸供给脱耦。 补能量没用，但把氨基酸混合物从1 mM加到5 mM就恢复。消耗最快的是天冬氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸。谷氨酰胺还会自发降解放氨。氨基酸混合物配好1周内用完，或者做滴加补料。
避坑总结 + 实操建议
三条核心结论：
1. 能量底物现配现用、-80°C分装，比任何配方优化都管用。
2. 每换一批裂