来源：蛋白纯化得率低镍柱再生（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
His标签蛋白过镍柱，洗脱峰小得可怜，SDS-PAGE上目标带淡到看不见。第一批还行，第二三次直接崩。别急着换新柱，大概率是再生没做对，Ni脱落了、柱床堵了，或者裂解上样条件早就有问题。下面从诱导、裂解、结合、洗涤、洗脱一路查到镍柱剥离-清洗-重挂镍，给你能直接照做的参数和验证方法。
第一步：快速排查低级错误
1. 菌体根本没诱导出目标蛋白？做诱导前后全菌SDS-PAGE，没带就别纯化。解决：OD600到0.6-0.8，加0.5 mM IPTG，18°C摇16 h或37°C摇3 h先做小试。
2. 裂解不彻底，上清里没多少可溶蛋白？看超声后样本还黏不黏。解决：每1 g湿菌加5-8 mL裂解液，加1 mg/mL溶菌酶，4°C放30 min，超声3 s开/5 s关，累计5-10 min。
3. 上样流速太快或柱床抽干？流穿液目标带比洗脱峰还浓。解决：重力柱控制0.5-1 mL/min，蠕动泵0.5 mL/min，液面别低于柱床。
4. 缓冲液含EDTA、DTT太高或pH偏酸？柱床发白、流穿目标多。解决：裂解液别加EDTA，DTT不超过1 mM，pH调到7.5-8.0再上样。
第二步：分维度系统排查
1. 诱导表达量够不够。现象：裂解上清和沉淀都看不到目标带。原理：蛋白没表达，或全进了包涵体。解决：做IPTG浓度0.1、0.5、1.0 mM，温度16°C 16 h、25°C 6 h、37°C 3 h小试，跑上清/沉淀。若在沉淀，按包涵体纯化，或降到16-18°C、IPTG 0.1 mM。验证：诱导后全菌目标带明显增粗，上清占可溶部分30%以上再放大。
2. 裂解和澄清不到位。现象：样本黏，柱子流速越来越慢。原理：核酸和碎片堵柱，目标蛋白没机会结合。解决：每1 g湿菌加5-8 mL裂解液：50 mM Tris pH 8.0，300 mM NaCl，10 mM imidazole，1 mM PMSF；加溶菌酶1 mg/mL，4°C 30 min；超声后12,000×g、4°C离心20-30 min，上清过0.45 μm膜。验证：上清跑胶目标带清晰，柱流速接近纯缓冲液。
3. 结合条件不合适。现象：流穿液目标带很浓，洗脱峰很小。原理：咪唑太高、盐太低、pH偏酸，或Ni柱载量超了。解决：平衡/上样用20 mM Tris pH 8.0，300 mM NaCl，10-20 mM imidazole；上样前测pH，用HCl或NaOH调回8.0。每mL Ni Sepharose按5-10 mg His蛋白估算，别超载；柱体积按培养体积1/100-1/50。流速0.5-1 mL/min。验证：流穿、洗涤、洗脱分别跑胶，目标带应在洗脱，不在流穿。
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