来源：哺乳细胞转染效率低脂质体DNA比例（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
转染做完48小时，荧光镜下绿点稀稀拉拉，阳性率5%～10%，细胞还掉了一片。这种局面十有八九不是质粒坏了，也不是细胞不行，而是脂质体和DNA的配比没踩到点上。比例偏低，DNA包不住；比例偏高，膜先被拆了。这篇教程按铺板→配复合物→加样→换液→检测的顺序，把每个环节里跟"比例"有关的坑摆出来，给你能直接上手的梯度方案和判断依据。
第一步：先花5分钟看这4个低级错误
1. 稀释脂质体用了PBS或纯水。 脂质体必须用Opti-MEM或无血清DMEM稀释，离子强度不够会立刻聚集成团，镜下能看到白色絮状物。换成Opti-MEM，每管50 µL。
2. µL和µg看串了。 Lipo3000是每µg DNA配1.5-2 µL试剂，很多人按"1:1质量比"去算，直接把母液体积加错。拿记号笔在管上写清"0.5 µg DNA / 1.5 µL Lipo"。
3. 复合物孵育时间不在谱上。 室温5分钟复合物还没成型，超过45分钟开始团聚。定15分钟，闹钟响就加。
4. 铺板密度超过85%或低于40%。 转染当天最稳的是70%-80%汇合，24孔板约1×10^5个细胞/孔，提前18-24小时铺。
第二步：分维度系统排查
这些没问题，再往下看。顺序按实验流程走，每一条都给你"怎么判断→怎么验证→怎么解决"。
模块一：铺板前——细胞状态决定了比例的上限
1. 细胞传代次数太高。现象：同一批质粒、同一比例，这周做出来比上周低一半。原理：P20代以后HEK293T的转染效率会明显下滑，膜表面电荷和摄取能力都变了。解决：换回P5以内的冻存管，连续传代别超过15次。验证：同时转一个已知高效的GFP质粒做阳性对照，阳性率低于80%说明是细胞问题，不是比例问题。
2. 铺板密度不对。现象：细胞太密，转染后24小时整片泛