来源：转录组测序比对率低rRNA去除效率（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
建完库、上机、下机，一看比对率60%，心凉半截。老板问是不是样本有问题，你只能干瞪眼。比对率低和rRNA残留，往往不是测序公司的锅，而是从提取到生信这条链上某一环漏了。下面按"先查低级错→再分模块系统查→最后看疑难"的顺序，一步步给你可执行的动作。
第一步：先别急着怪测序，查这4个低级错误
1. 参考基因组版本对不上号。人样本用了小鼠的GRCm39，比对率能到10%算你运气好。换回GRCh38 + GENCODE v44，重跑STAR，看是否跳回85%以上。
2. FASTQ贴错标签、样本串了。先跑md5核对，再抽10万reads比对rRNA和线粒体库，若某样本线粒体占比>60%，基本是分组或组织搞混了。
3. rRNA去除试剂盒和物种不匹配。用Human/Mouse rRNA Removal Kit去植物叶片的总RNA，探针根本杂交不上，rRNA能剩50%以上。核对货号对应的物种再动手。
4. 接头和低质量碱基没trim就比对。读长150 bp，接头占30 bp，STAR会把整条read判为unmapped。fastp跑一遍，`--detect_adapter_for_pe`，Q20、长度≥36 bp过滤后再比对。
第二步：按流程分模块系统排查
模块A：总RNA本身的质量
1. RIN值偏低或gDNA残留
现象：Bioanalyzer 2100图上28S/18S比值<1.0，或者RIN只有5~6。
原理：RNA降解后，逆转录酶从随机引物起始的效率骤降，文库出现严重3'偏好。比对到基因5'端的reads几乎为零，整体比对率被硬生生拉低。
解决：重新提RNA，Trizol法加一步75%乙醇洗两次；DNase I 37°C 15 min消化gDNA，80°C 10 min灭活。RIN≥7再建库，RIN<5的样本直接换。
验证：Agilent 2100看RIN和28S/18S；qPCR用GAPDH引物，Ct>28或熔解曲线双峰就说明降解。
2. 起始量太少或太多
现象：PCR循环数被迫加到16以上，duplication rate飙到80%。
原理：循环数越高，rRNA残留的绝对分子数被同步放大，index hopping也增加，比对率下降。
解决：起始总RNA控制在100 ng~1 μg，rRNA去除后留100 ng以上做建库；PCR循环数压到12~14。
验证：看FastQC的duplication模块，>60%就得回头调起始量。
模块B：rRNA去除环节（重点）
3. 探针杂交条件不对
现象：去rRNA后Qubit测浓度掉了一半，上机后rRNA占比仍有40%。
原理：探针法靠生物素标记的rRNA互补寡核苷酸杂交，再用链霉亲和素磁珠拉走。杂交温度低了探针结合不牢，温度高了非特异结合增加。
解决：杂交缓冲液预热到68°C，RNA+探针68°C 5 min，再缓慢降温到25°C（每秒降0.1°C）；磁珠提前室温平衡30 min，结合时室温15 min，别放冰上。
验证：取去除后RNA 10 ng做qPCR，检测18S/28S，相对未去除样本ΔCt下降≥10个循环算合格。
4. 去除后没做rRNA残留QC
现象：直接把去除产物拿去建库，建完才发现rRNA占35%。
原理：不同物种、不同组织rRNA占比差别大，肌肉能到80%，培养细胞约60%，一次去除往往不够。
解决：qPCR或TapStation检测残留；若rRNA仍>10%，做第二次去除，探针量按说明书加倍。
验证：SortMeRNA或bowtie2比对到Silva/rRNA数据库，统计rRNA reads占比，目标<5%。
模块C：建库与测序环节
5. 片段化和逆转录条件失控
现象：插入片段集中在150 bp以下，比对工具输出大量soft-clip。
原理：94°C片段化时间过长，RNA断成小片段，逆转录后拼不出完整文库，双端reads接不上。
解决：94°C 8 min，别超过10 min；逆转录用SuperScript IV，50°C 30 min，70°C 15 min灭活。
验证：Agilent High Sensitivity DNA chip看平均片段，目标350~450 bp。
6. 链特异性建库方向搞反
现象：比对率看着有92%，但featureCounts统计到的全是反义链，表达量全乱。
原理：dUTP法建库时第二链含dUTP会被UDG酶切。忘记加UDG或加错，链方向就反了。
解决：确认试剂盒