来源：基因合成片段GC含量高扩增困难（DNA Lab Space 实验教程）| 编译：DNA Lab Space
你刚拿到合成的基因片段，GC含量75%，PCR跑了两板全是引物二聚体。别急。高GC不等于不能扩。它只是喜欢跟你对着干：二级结构多，退火温度高，普通Taq容易掉链子。这篇教程按“快速排错—系统排查—进阶疑难”走，覆盖模板、引物、程序、添加剂、酶和分段组装。给你能直接上手的参数和验证动作。
第一步：快速排查低级错误
1. 模板加太多或太少。合成片段常是干粉，稀释错10倍很常见。解决：用TE稀释到10 ng/µL，PCR加1 µL，即10 ng。模板梯度设1、5、10 ng。
2. 引物没稀释或反复冻融。引物母液100 µM，工作液10 µM，加0.5-1 µL。解决：新稀释，检查OD。
3. 退火温度照搬普通PCR。高GC的Tm可能70°C以上。解决：设梯度56-68°C，先跑8个温度。
4. 忘了加GC enhancer或Mg²⁺。普通缓冲液对高GC不够。解决：加5% DMSO或1.5 M甜菜碱，Mg²⁺提到2 mM。
第二步：分维度系统排查
1. 模板质量与二级结构
现象：无带或smear，qPCR Ct>35。原理：高GC形成稳定发夹、G四联体，聚合酶滑不过去。解决：模板95°C 5 min，冰上2 min；稀释到1-10 ng/µL；加7-deaza-dGTP 0.1 mM。验证：跑2%琼脂糖，看有没有模板自连。先看模板。
2. 引物设计
现象：目的带弱，引物二聚体浓。原理：高GC引物易自配对，退